双层复合缓释微球在制备预防和治疗骨质疏松，关节炎和软骨恢复药物中的应用的制作方法

本发明属于医学临床用药领域。具体的说，涉及缓释微球在制备预防和治疗骨质疏松，关节炎和软骨恢复药物中的应用。

背景技术：

目前，关节退化及关节炎已成为严重影响高龄人口生活质量的一项备受关注的议题。研究发现65岁以上族群罹患膝盖关节炎的盛行率为10-20％，且该膝盖关节炎的严重程度随年龄增加而恶化。世界卫生组织的报告亦显示自2003年起至今，世界范围内超过60岁以上而受关节炎所苦的人口有增加趋势，足见关节炎的问题急待解决。

位于关节中的软骨会随着年龄流失，亦会因为走路、跑步、跳跃等频繁使用关节的运动而磨损，导致退化性关节炎的发生，令患者感到关节僵硬与疼痛。此外，关节软骨的损伤还可能造成硬骨摩擦而产生骨刺，严重影响关节的正常功能。

为了预防或改善关节炎和软骨损伤等现象，较普遍的简易疗法包含避免过度的、 负重的运动，及锻炼关节周边的肌肉以分担运动时的关节受力；另外，尚可使用非固醇类抗发炎药缓和关节发炎及疼痛。然而，前述方法的效果有限，且部分使用非固醇类抗发炎药的患者还会出现消化不适，甚至消化道溃疡等副作用。因此，若能同时促进软骨再生与抑制发炎反应的办法，便能更有效解决骨关节疾病所导致的生活不便。

传统方式摄入药物后，大多数药物成分迅速得到释放，导致人体内药物浓度迅速升高，达到峰值后迅速降低，剧烈的波动往往引起在峰值时产生不可接受的副作用，而后又因为血清中药物的浓度过低导致治疗效果不充分。为了保证体内必要的药物浓度，只能采用一日数次定时服药。即便如此体内的血药浓度仍然处于波动状态。传统方式给药也都存在药物有效性、安全性低，患者服从性低等问题，因此，对于药物释放系统的研究更迫在眉睫。

而双层微球以其结构的特殊性、性能的多变性、应用的广泛性，在医药、生物医学工程领域有着十分重要的作用。它能够作为口服药物载体，进入人后，一方面通过外层保护药物不被胃酸等破坏，另一方面，还能够在肠道中缓慢释放内层所载的药物，保持血药浓度。

因此，开发一种口服用的具预防和治疗骨质疏松，关节炎和软骨恢复的双层结构的载药微球，是十分有必要和具有广泛应用价值的。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种双层复合缓释微球在制备预防和治疗骨质疏松，关节炎和软骨恢复药物中的应用，本发明双层复合缓释微球，由外层和内层两部分组成。内层为聚己内酯-甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸（PLGA-PCL-MPEG）共聚物负载羧甲基海藻酸钠、软骨素和胶原蛋白肽形成的微球，外层包覆层由壳聚糖CS，聚乳酸PLA，聚乙二醇PEG和羟基磷灰石HA组成，具体制备方法如下：

1）对所有的用于生产制备双层复合缓释微球的原材料和辅助用材料按照对应的质量标准进行检验和称量，符合规定的质量标准。

2）配制羧甲基海藻酸钠、软骨素和胶原蛋白肽的混合溶液。

2.1分别称量一定比例量的羧甲基海藻酸钠、软骨素、胶原蛋白肽于匀浆机中。

2.2 量取适量的二氯甲烷500ml，并倒入2.1的匀浆机中。

2.3 在50℃微波条件下，匀浆机开始剪切搅拌，搅拌速率为70-110rpm，剪切搅拌时间为1-2h，形成混合均匀的溶液，放入冰箱中低温备用，并在12小时内使用完毕。

3）配制载体溶液。

3.1 配置合成嵌段共聚物的有机溶剂，将适量偶氮二异丁腈和2,2'-联吡啶分别作为引发剂和催化剂加入到四氢呋喃溶液中，室温下搅拌混合均匀，得到透明的混合溶液。

3.2 采用活性可控的原子转移自由基聚合技术，在偶氮二异丁腈/2,2'-联吡啶/四氢呋喃的反应体系下，在微波辐射条件下，加入质量比为3:2:1的聚己内酯和甲氧基聚乙二醇以及聚乳酸-羟基乙酸进行反应，反应完全后离心洗涤得到聚己内酯-甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸（PLGA-PCL-MPEG）嵌段共聚物用二氯甲烷分散备用。

4）微流控芯片技术生成内层载药微球。

4.1 将2.3得到的溶液注入第一流道，3.2得到的溶液注入第三流道，聚乙烯醇注入第二流道作为剪切相。

4.2 第一、第二和第三流道中的介质同时注入交汇流道并充分碰撞剪切制备乳液，将得到的乳液挥发有机溶剂，分别采用水和丙酮离心洗涤后冷冻干燥，即得到内层载药微球。

5）采用加压包裹法制备双层复合微球。

5.1 将一定配比量的壳聚糖CS，聚乳酸PLA，聚乙二醇PEG和羟基磷灰石HA分散到氯仿中，搅拌一定时间至溶解均匀。

5.2 将4.2得到的载药微球均匀平铺在表面光洁强度足够的平面上，用另一个表面光洁强度足够的平面压在载药微球上进行加压，调整到合适的压力后，在载药微球周围滴加5.1得到的溶液，常温下至氯仿挥发后重复滴加至包覆完成，得到载有促进骨形成蛋白及消除关节炎症状药物的的双层复合缓释微球。

进一步的，步骤2.1中羧甲基海藻酸钠、软骨素、胶原蛋白肽的配比为1-3:1:1-2。

进一步的，步骤2.3中溶液中分散的溶质含量为250-550μg/ml。

进一步的，步骤3.2中偶氮二异丁腈、2,2'-联吡啶和四氢呋喃质量配比为10-50:1:100-300。

进一步的，步骤5.1中壳聚糖CS，聚乳酸PLA，聚乙二醇PEG和羟基磷灰石HA质量配比为1-10:2-8:3-14:5-9，氯仿的加入量为溶解完全为止。

进一步的，步骤5.2中合适的压力为0.2-0.5MPa。

进一步的， 步骤3.2中微波辐射功率为400-800W，辐射时间为20min-4.5h。

进一步的，得到的双层复合微球包覆率为70%-95%。

进一步的，步骤4.1中用到的2.3得到的溶液中溶质与用到的3.2得到的溶液中溶质的质量比为1:50-200。

本发明的有益效果：首次将PLGA-PCL-MPEG用于载药体，该嵌段共聚物无毒、无热敏性，且具有良好的组织相容性，且有一定的消炎作用，相对于传统的MPEG-PCL嵌段聚合物作为载体对于缓释药物方便有明显提高，并有效提高治疗效果。羧甲基海藻酸钠可有效促进BMP骨形态发生蛋白的生成，而补充软骨素可降低关节炎的发生几率，有效缓解关节炎产生的疼痛感，软骨中的胶原蛋白肽，与软骨素的相互作用，不仅能够提高软骨缓冲避免关节炎，还能够提供关节所需的抗压能力，并保持钙不流失，预防骨质疏松的风险；同时，制备得到双层缓释微球，增加了微球的机械强度性能，有利于在体内缓慢释放消化，通过调整压力改变内层载药微球的包覆率，进而调整药物释放速度，利于研究不同药物释放速度对疾病的影响，提高治疗效果并降低治疗费用。

附图说明

图1是实施例1制备得到的得到内层载体微球的透射电镜图；

图2是实施例1制备得到的得到的双层复合缓释微球的扫面电镜图；

图3是实施例1得到的双层复合缓释微球在pH=6的缓冲溶液中的释放曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明技术方案的实施和所具有的有益效果，但不能认定为对本发明的可实施范围的任何限定。

实施例1

1）对所有的用于生产制备双层复合缓释微球的原材料和辅助用材料按照对应的质量标准进行检验和称量，符合规定的质量标准。

2）配制羧甲基海藻酸钠、软骨素和胶原蛋白肽的混合溶液。

2.1按照质量比3:1:2比例分别称取羧甲基海藻酸钠、软骨素、胶原蛋白肽于匀浆机中。

2.2 量取适量的二氯甲烷500ml，并倒入2.1的匀浆机中。

2.3 在50℃微波条件下，匀浆机开始剪切搅拌，搅拌速率为70-110rpm，剪切搅拌时间为1-2h，形成混合均匀的溶液，溶液中分散的溶质含量为500μg/ml，放入冰箱中低温备用，并在12小时内使用完毕。

3）配制载体溶液。

3.1 配置合成嵌段共聚物的有机溶剂，将适量偶氮二异丁腈和2,2'-联吡啶分别作为引发剂和催化剂加入到四氢呋喃溶液中，室温下搅拌混合均匀，得到透明的混合溶液，偶氮二异丁腈、2,2'-联吡啶和四氢呋喃的质量比为25:1:200。

3.2 采用活性可控的原子转移自由基聚合技术，在偶氮二异丁腈/2,2'-联吡啶/四氢呋喃的反应体系下，在600W功率的微波辐射条件下，加入质量比为3:2:1的聚己内酯和甲氧基聚乙二醇以及聚乳酸-羟基乙酸进行反应50min，反应完全后离心洗涤得到聚己内酯-甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸（PLGA-PCL-MPEG）嵌段共聚物用二氯甲烷分散备用。

4）微流控芯片技术生成内层载药微球。

4.1 将2.3得到的溶液注入第一流道，3.2得到的溶液注入第三流道，上述两种溶液中溶质的质量比为1:100，聚乙烯醇注入第二流道作为剪切相。

4.2 第一、第二和第三流道中的介质同时注入交汇流道并充分碰撞剪切制备乳液，将得到的乳液挥发有机溶剂，分别采用水和丙酮离心洗涤后冷冻干燥，即得到平均粒径为500nm的内层载药微球（如图1所示）。

5）采用加压包裹法制备双层复合微球。

5.1 分别将质量配比为2:7:11:9的壳聚糖CS，聚乳酸PLA，聚乙二醇PEG和羟基磷灰石HA分散到氯仿中，搅拌一定时间至溶解均匀。

5.2 将4.2得到的载药微球均匀平铺在表面光洁强度足够的平面上，用另一个表面光洁强度足够的平面压在载药微球上进行加压，调整到0.3MPa，在载药微球周围滴加5.1得到的溶液，常温下至氯仿挥发后重复滴加四次，得到包覆率为85%的载有促进骨形成蛋白及消除关节炎症状药物的的双层复合缓释微球，所得微球平均粒径为1.1μm（如图2所示）。

6）将得到的双层复合缓释微球在pH为6的磷酸二氢钠缓冲溶液中，利用动态膜透析方法，考察其时间与释放率的规律，结果如图3所示。

结果表明，在前35小时，药物的释放速率相对较快，随着时间延长，微球释放速率逐渐减慢，在第300小时释放了39%的药物，有效延长了药物的作用时间，提高治疗效果并减少给药次数，能够有效减轻患者负担。

对比例1

与实施例1的步骤基本相同，唯一区别在于步骤3.2中加入质量比为1:1的聚己内酯和甲氧基聚乙二醇。而采用与实施例1相同的测试释放速率与时间关系的方法，对比例1的微球在第300小时释放了53%的药物。

对比例2

与实施例1的步骤基本相同，唯一区别在于步骤5.2的压力为常压。而采用与实施例1相同的测试释放速率与时间关系的方法，对比例1的微球在第300小时释放了48%的药物。

对比例3

与对比例1的步骤基本相同，唯一区别在于步骤5.2的压力为常压。而采用与对比例1相同的测试释放速率与时间关系的方法，对比例1的微球在第300小时释放了65%的药物。