本发明属于生物医药领域，具体涉及温敏性长效缓释药物载体及其应用，更具体地，涉及温敏性长效缓释药物载体、缓释药物、分离的多肽、分离的核酸、重组载体，以及分离的多肽、分离的核酸和重组载体在制备药物中的用途。
背景技术：
：蛋白质偶联物由于可以增大小分子蛋白质的水合半径，从而逃逸肾脏清除作用，已经成为有效延长蛋白药物循环半衰期最常用的方法。目前，解决这些问题的最常用方法是用聚乙二醇(peg)修饰蛋白质药物，这种方法通常被称为peg化(pegylation)。用聚乙二醇(peg)修饰ifn，能有效改善其药代动力学，改善药物分布，提高其疗效。然而，pegylation通常产生非均相的位点异构体混合物，难以分离和纯化，同时也具有活性低，特异性差，分子量无法精确控制等明显的局限性。另外，将治疗性蛋白融合到人血清白蛋白(hsa)和抗体的fc片段等长效循环蛋白是另一种延长其循环半衰期的方法。通过融合人血清白蛋白能够有效提高干扰素循环半衰期并有效控制修饰位点，但活性保持仅有1％，且临床试验效果并不明显。此外，药用蛋白-hsa需要在真核表达系统中生产，产率低、成本高。fc融合也有其自身问题，如免疫原性，蛋白活性和稳定性低，以及异构糖基化。最近，无规卷曲的多肽被用于提高药物蛋白的体内半衰期，包括xten化,pas化,和elp化。这些方法可以将药物蛋白在小鼠体内半衰期延长到1-2天，将给药频率降低到每周一次。然而，这些方法很难进一步显著提高药代水平。因此，蛋白药物递送载体有待研究。技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种温敏性缓释药物载体，通过对载体的重复氨基酸序列和序列大小进行限定，从而降低药物载体的相变温度，使该载体在体内呈凝胶状，显著降低了药物的释放速率，改善了药物的半衰期。需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：类弹性蛋白多肽(elp)具有温敏性可逆相变的特性，其中，可逆相变是指类弹性蛋白在两相之间在一定温度时的相平衡压力下发生的相变化，也就是说，若环境温度低于它的相变温度,该多肽在水溶液中为高度可溶；相反,当环境温度高于该相变温度时，富含水的多肽链结构脱水，并开始聚集，形成一个富含elp的聚集物，并且这个相变过程是可逆的。发明人研究发现，elp的相变温度可随氨基酸的疏水性和重复单元的数量而改变。而且elp具有生物相容性，无毒无免疫原性。而且可以应用基因工程与蛋白和多肽融合用于蛋白和多肽的纯化和转运，进而利用elp蛋白的温敏可逆相变特性可以实现蛋白类药物的温度依赖性可控释放，进而将循环半衰期延长与温度依赖性可控释放结合起来，用于温敏性缓释药物载体，并用于小分子蛋白和多肽类药物的给药。同时，发明人对载体的重复氨基酸序列和序列大小进行优化，使药物载体的相变温度降低，使该载体在体内呈凝胶状，显著降低了药物的释放速率，改善了药物的半衰期。通过基因工程技术将药用蛋白与elp的n末端融合，形成温敏性融合蛋白，调控其重复单元数量使相变温度低于体温。从而皮下注射的elp融合蛋白会从溶液中析出并在注射部位皮下形成凝胶储库。我们进一步提出，由于elp相变温度具有浓度依赖性，储库中边缘的elp融合蛋白分子会在相当长的一段时期内逐渐溶解扩散释放进入血液循环系统。elp融合蛋白具有通过高渗透性与滞留效应介导的被动靶向肿瘤的优势，因此我们选择了肿瘤模型作为实施例，验证了该elp融合蛋白在肿瘤治疗中的功效。结果表明一次性皮下注射温敏性ifn-elp融合蛋白表现出大大增强的肿瘤聚集并根治肿瘤。这种温敏性长效缓释蛋白递送途径在提高药代表现方面具有显著优势，适用于很多药用蛋白和多种疾病治疗，不仅可减少给药频率，还可极大提高治疗效果，同时降低毒副作用，从而大大提高患者的生活质量。因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种温敏性长效缓释药物载体。根据本发明的实施例，该温敏性长效缓释药物载体包括：重复氨基酸序列(xgvpg)n，其中，n为不小于30的整数，x是除脯氨酸以外任何一种氨基酸。根据本发明实施例的温敏性缓释药物载体，通过对载体的重复氨基酸序列和序列大小进行限定，从而降低药物载体的相变温度，使该载体在皮下呈凝胶状，并缓释蛋白药物入血，实现蛋白药物的零级释放，显著降低了药物的释放速率，有效突破传统的药代提高途径中延长半衰期的限制，根据本发明的一些实施例，该药物载体可以将蛋白药物的循环半衰期延长几百倍，并显著提高了药物的生物利用度，改善了药代动力学参数。另外，根据本发明上述实施例的温敏性长效缓释药物载体，还可以具有如下附加的技术特征：根据本发明的实施例，n为30-200的整数。根据本发明的优选实施例，n为60-120的整数。由此，相变温度适宜，药物的半衰期更长。根据本发明的实施例，所述药物载体的相变温度为20-36摄氏度。由此，相变温度适宜，药物的半衰期更长。根据本发明的第二方面，本发明提供了一种缓释药物。根据本发明的实施例，该缓释药物包括：前述的温敏性长效缓释药物载体；治疗剂，所述治疗剂与所述药物载体操作地相关联，所述治疗剂为蛋白质类物质。根据本发明实施例的缓释药物，通过将蛋白质类治疗剂与前述的温敏性缓释药物载体相关联，显著降低了药物的释放速率，有效突破传统的药代提高途径中延长半衰期的限制，显著延长了药物的半衰期，改善了药代动力学参数，提高药物的疗效，降低药物的毒副作用。根据本发明的实施例，所述蛋白质类物质为选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体。根据本发明的实施例，所述蛋白质类物质的分子量为1000-300000da。根据本发明的实施例，所述蛋白质类物质为干扰素、粒细胞集落刺激因子、瘦素、胰高血糖素样肽-1及其类似物和水蛭素的至少一种。根据本发明的实施例，所述干扰素为干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ。根据本发明的第三方面，本发明提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所述多肽包括：载体序列，所述载体序列包括重复氨基酸序列(xgvpg)n，其中，n为不小于30的整数，x是除脯氨酸以外任何一种氨基酸；以及治疗剂序列，所述治疗剂序列编码前述的治疗剂。由此，该分离的多肽表达前述的缓释药物，具有前述的缓释药物的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。根据本发明的实施例，n为30-200的整数。根据本发明的优选实施例，n为60-120的整数。由此，相变温度适宜，与该多肽连接的药物的半衰期更长。根据本发明的第四方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前述的多肽。该核酸具有前述多肽的全部技术特征和技术效果，在此不再赘述。根据本发明的第五方面，本发明提供了一种重组载体。根据本发明的实施例，所述重组载体含有前述的核酸。该载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。例如，该载体可以是质粒。根据本发明的第六方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞含有前述的重组载体。该重组细胞具有前述核酸的全部技术特征和技术效果，在此不再赘述。根据本发明的第七方面，本发明提供了前述的分离的多肽、前述的分离的核酸、前述的重组载体和前述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物的半衰期不低于1周。由此，药物的释放速率缓慢，半衰期显著延长，药代动力学参数好，药物的疗效提高了，药物的毒副作用小。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例的通过itc纯化获得ifn-elp和镍柱亲和层析纯化获得ifn的结果示意图；图2显示了根据本发明一个实施例的maldi-tof分析ifn-elp和ifn的分子量的结果示意图；图3显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp和ifn的水合半径结果示意图；图4显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp和ifn的二级结构示意图；图5显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp(v)和ifn-elp(a)的相转变温度结果示意图；图6显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp相转变温度的浓度依赖性结果示意图；图7显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp和ifn的体外生物活性结果示意图；图8显示了根据本发明一个实施例的静脉注射低浓度ifn-elp和ifn在裸鼠体内的血药浓度随时间的变化结果示意图；图9显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp和ifn的最大耐受剂量和二次注射后小鼠存活情况结果示意图；图10显示了根据本发明一个实施例的皮下最大耐受剂量注射后ifn-elp(v)在原位形成储库随时间的变化情况的结果示意图；图11显示了根据本发明一个实施例的皮下注射高浓度ifn-elp和ifn在裸鼠体内的血药浓度随时间的变化的结果示意图；图12显示了根据本发明一个实施例的皮下高浓度给药后循环系统中ifn-elp和ifn的药时曲线面积随时间变化曲线的结果示意图；图13显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp和ifn在肿瘤及其他组织中的分布结果示意图；图14显示了根据本发明一个实施例的皮下最大耐受剂量给药后ifn-elp和ifn抑制肿瘤生长情况的结果示意图；图15显示了根据本发明一个实施例的小鼠皮下最大耐受剂量注射药物后肿瘤生长情况示意图；图16显示了根据本发明一个实施例的小鼠皮下最大耐受剂量注射药物后的生存曲线结果示意图；图17显示了根据本发明一个实施例的皮下最大耐受剂量注射药物后裸鼠体重随时间的变化结果示意图；图18显示了根据本发明一个实施例的皮下最大耐受剂量注射药物后裸鼠肿瘤及其他组织的组织学变化情况的结果示意图；图19显示了根据本发明一个实施例的小鼠皮下最大耐受剂量注射药物后肾、肝、心脏功能生理指标和血液指标变化情况的结果示意图；图20显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp和ifn的溶血检测的结果示意图；图21显示了根据本发明一个实施例的ifn-elp质粒构建的方法流程示意图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。根据本发明的第一方面，本发明提供了一种温敏性长效缓释药物载体。根据本发明的实施例，该温敏性长效缓释药物载体包括：重复氨基酸序列(xgvpg)n，其中，n为不小于30的整数，x氨基酸是除脯氨酸以外任何一种氨基酸。本发明所用术语“药物载体”，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。根据本发明实施例的温敏性长效缓释药物载体，通过对载体的重复氨基酸序列和序列大小进行限定，从而降低药物载体的相变温度，使该载体在体内呈凝胶状，并缓释蛋白药物入血，实现蛋白药物的零级释放，显著降低了药物的释放速率，有效突破传统的药代提高途径中延长半衰期的限制，根据本发明的一些实施例，该药物载体可以将蛋白药物的循环半衰期延长几百倍，并显著提高了药物的生物利用度，改善了药代动力学参数。其中，需要说明的是，本文“体内呈凝胶状”是指药物载体在给药部位聚集，形成富含elp的聚集物，该聚集物呈凝胶状，而给药部位可以根据疾病的种类，治疗的部位和药物的种类等进行选择，可以是皮下给药，即形成皮下凝胶，也可以是腹腔给药，即在腹腔内形成凝胶，或是瘤内给药，即在肿瘤内部形成凝胶，以及其它可行的给药方式。发明人研究发现，通过调整药物载体重复氨基酸序列的重复次数可以调节相变温度(tt)。研究发现，n与tt之间呈负相关，重复单元数越多，相变温度越低，发明人发现当n为30-200的整数，尤其是80-120的整数时，既保证相变温度低于体温，在体内呈凝胶状，实现体内聚集，药物能够长效缓释，又具有良好的组织渗透性，生物利用率高。如果n过大，则融合蛋白分子量过大，即尺寸过大，会导致组织渗透性差而影响药效；而如果n过小，相变温度过高，则无法达到有效的体内聚集(如皮下聚集)，无法实现药物的长效缓释。根据本发明的实施例，药物载体的相变温度为20-36摄氏度，优选地，可以为23-24摄氏度。药物载体的相变温度低于体温，药物载体会从溶液中析出并在注射部位皮下形成药物载体的储库。由于药物载体的相变温度具有浓度依赖性，储库中边缘的药物载体分子会在相当长的一段时期内逐渐溶解扩散释放进入血液循环系统，从而实现药物的缓慢释放，显著延长了药物的半衰期。根据本发明的一些实施例，该药物载体与蛋白药物融合得到的缓释药物实现了为期一个月的零级持续释放，极大地改善了干扰素在体内的半衰期。根据本发明的第二方面，本发明提供了一种长效缓释药物。根据本发明的实施例，该长效缓释药物包括：前述的温敏性长效缓释药物载体和治疗剂，该治疗剂与药物载体操作地相关联，该治疗剂为蛋白质类物质。本文所用术语“治疗”是指疾病或疾病状态的任何不期望的病征或症状的任何程度的减轻、预防或抑制。这些不期望的病征可以包括使个体的良好状态或外观的整体感觉恶化的那些病征。这个术语并非必须意味着疾病或疾病状态的完全治愈或消失。“治疗剂”是指在以治疗有效量向哺乳动物给药时，向该哺乳动物提供治疗益处的化合物。本文中，治疗剂可以指药物。本领域技术人员应当理解，术语“治疗剂”并不限于得到监管机构批准的药物。“治疗剂”可以与至少一种类弹性蛋白多肽载体和/或其他试剂操作地相关联。本文中的至少两个分子“操作地相关联”，即可以是这几个分子直接地关联，中间不含有其它分子，也可以是间接地关联，中间含有其它的分子。例如，重复氨基酸序列(xgvpg)n的n端或c端可以直接与治疗剂的c端或n端相连，也可以二者之间含有其他的肽段。同时，“操作地相关联”表示分子之间存在电子相互作用。这类相互作用可以采取化学键的形式，其包括但不限于共价键、极性共价键、离子键、静电缔合、配位共价键、芳香键、氢键、偶极或范德华相互作用。本领域的普通技术人员理解，这些相互作用的相对强度可以变化很大。根据本发明实施例的长效缓释药物，通过将蛋白质类治疗剂与前述的温敏性缓释药物载体相关联，显著降低了药物的释放速率，有效突破传统的药代提高途径中延长半衰期的限制，显著延长了药物的半衰期，改善了药代动力学参数，提高药物的疗效，降低药物的毒副作用。根据本发明的实施例，该蛋白质类物质的分子量为1000-300000da。该蛋白质类物质的分子量较小，容易被体内蛋白酶降解和肾排出，循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，尤其适于通过前述的温敏性长效缓释药物载体，避免蛋白酶降解和肾排出，延长药物的半衰期。根据本发明的实施例，所述蛋白质类物质为选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽和抗体。例如，可以是治疗性蛋白如胰岛素，单克隆抗体，血液因子，集落刺激因子，生长激素，白介素，生长因子，治疗性疫苗，降钙素，肿瘤坏死因子(tnf)和酶等。具体地，包括，但不限于：天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶，表皮生长因子(egf)、胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子(tgf)、神经生长因子(ngf)、血小板衍生的生长因子(pdgf)，骨形态发生蛋白(bmp)，成纤维细胞生长因子、生长抑素、生长激素、生长激素、生长激素抑制素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(csf)、凝血因子、肿瘤坏死因素、干扰素、白细胞介素、胃肠肽、血管活性肠肽(vip)、肠促胰酶肽(cck)，胃泌素，促胰液素、促红细胞生成素、荷尔蒙、抗利尿激素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺激素释放激素(trh)、促甲状腺激素、；促黄体生成激素、促黄体激素释放激素(lhrh)、组织型纤溶酶原激活剂、白细胞介素-1、白细胞介素-15、受体拮抗剂(il-1ra)、胰高血糖素样肽-1(glp-1)、瘦素、生长素、粒单核细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素-2(il-2)、腺苷脱氨酶、尿酸酶、天冬酰胺酶、人生长激素、天冬酰胺酶；巨噬细胞活化；绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、逆转录病毒载体、松弛肽；环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体等。根据本发明的优选实施例，该蛋白质类物质可以为干扰素、粒细胞集落刺激因子、瘦素、胰高血糖素样肽-1及其类似物和水蛭素的至少一种。根据本发明的实施例，该干扰素为干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ。根据本发明的第三方面，本发明提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所述多肽包括：载体序列，所述载体序列包括重复氨基酸序列(xgvpg)n，其中，n为不小于30的整数，x氨基酸是除脯氨酸以外任何一种氨基酸；以及治疗剂序列，所述治疗剂序列编码前述的治疗剂。由此，该分离的多肽表达前述的缓释药物，具有前述的缓释药物的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。根据本发明的实施例，n为30-200的整数。根据本发明的优选实施例，n为60-120的整数。由此，多肽的相变温度低于体温，在体内呈凝胶状，实现体内聚集，药物能够长效缓释，又具有良好的组织渗透性，生物利用率高。根据本发明的第四方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前述的多肽。该核酸具有前述多肽的全部技术特征和技术效果，在此不再赘述。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的dna、rna，其长度不受任何特别限制。根据本发明的第五方面，本发明提供了一种重组载体。根据本发明的实施例，所述重组载体含有前述的核酸。该载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。例如，该载体可以是质粒。本发明中所使用的术语“重组载体”是指这样的一种遗传载体，包含特定的核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，重组载体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，重组载体可以为质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。病毒很容易转染到受体细胞中。本领域技术人员可以根据需要进行选择。对于用于构建重组细胞的重组载体，优选所述核酸为dna，因为dna相对于rna而言，其更稳定，并且易于操作。根据本发明的第六方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞含有前述的重组载体。该重组细胞具有前述核酸的全部技术特征和技术效果，在此不再赘述。根据本发明的实施例，该重组细胞可以通过将前述载体转化至宿主细胞而得到。根据本发明的第七方面，本发明提供了前述的分离的多肽、前述的分离的核酸、前述的重组载体和前述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物的半衰期不低于1周，甚至可长达20天。由此，药物的释放速率缓慢，半衰期显著延长，药代动力学参数好，药物的疗效提高了，药物的毒副作用小。下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自sigma公司。实施例1本实施例中，构建ifn-elp融合蛋白质粒并在大肠杆菌中表达，具体如下：elp(v)序列的氨基酸重复单元为:(vgvpg)，共重复90次。由生工生物技术(上海，中国)合成包含重复单元和bseri/acui粘性末端的基因片段。上游片段：5’gcgtgggtgttccgggcgtaggtgtcccaggtgtgggcgtaccgggcgttggtgttcctggtgtcggcgtgccgggc3’(seqidno：1)下游片段：5’tagcccggcacgccgacaccaggaacaccaacgcccggtacgcccacacctgggacacctacgcccggaacacccac3’(seqidno：2)通过bseri/acui酶切位点插入到pet-25b(+)载体中，通过滚环法质粒构建获得18个如上重复单元的质粒。elp(a)序列的氨基酸重复单元为:(agvpg),共重复90次。由生工生物技术(上海，中国)合成包含重复单元和bseri/acui粘性末端的基因片段，上游片段：5’gcgcaggtgtgccgggcgcgggtgttccgggcgcaggtgtcccgggc3’(seqidno：3)下游片段：5’cagcccgggacacctgcgcccggaacacccgcgcccggcacacctgc3’(seqidno：4)通过bseri/acui酶切位点插入到pet-25b(+)载体中，通过滚环法质粒构建获得30个如上重复单元的质粒。ifn基因序列(ncbigi386795)由生工生物技术(上海，中国)合成并插入-t载体中。利用pcr技术，从-t载体中扩增ifn编码序列，通过bseri/acui酶切位点插入到pet-25b(+)载体中，通过质粒构建获得含有ifn-elp基因的质粒，其中，ifn基因序列如下：atgtgtgatctgcctcagactcattctctgggtagtcgtcgtacgctgatgctgctggctcaaatgcgccgtattagcctgttttcttgcctgaaagatcgccacgattttgggtttccacaggaagaatttggcaaccagttccagaaagccgaaacaattccggtactgcacgagatgattcaacaaatctttaacctgttcagcaccaaagactcttctgctgcctgggatgaaacactgctggacaaattctataccgagctgtatcagcaactgaacgatctggaggcatgtgttattcagggtgttggtgtgactgaaactccgctgatgaaagaggatagcattctggcagtccgtaaatattttcagcgtatcacactgtatctgaaagagaaaaaatatagcccgtgtgcctgggaagttgttcgtgccgaaatcatgcgcagctttagtctgtctaccaacctgcaagagagcctgcgttctaaagaa(seqidno：5)该ifn基因序列引物如下：上游引物：5’gagatagaggagtacatatgggctgtgatctgcctcagactcatt3’下游引物：5’tttccgctgaaggcagagagccaccgccaccggatccttctttagaacgcaggctct3’ifn-elp质粒构建方法如图21所示，构建得到质粒后在大肠杆菌(rosetta-gami(de3)plyss，novagen)中表达。在大规模的表达之前，先将转化得到的单克隆菌接种在50mltb培养基中(含100μg/ml卡那霉素)，在37℃、180rpm条件下震荡培养过夜。第二天再转接入1l新鲜tb培养基当中(盛在2l的摇瓶中，卡那霉素浓度为100μg/ml)进行大规模培养并诱导表达。具体步骤如下：首先在37℃，200rpm条件下震荡培养5h，随后将培养温度设为18℃，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，终浓度为0.5mm，培养16h后收集菌体。实施例2本实施例中，对实施例1培养获得的ifn-elp融合蛋白进行纯化，具体如下：1、本实施例中采用反相转变循环技术(inversetransitioncycling,itc)纯化ifn-elp。具体方法如下：(1)将1l大肠杆菌培养液收集于离心瓶，以3000×g离心力离心收集菌体，去除上层培养液。(2)用30ml冰冷pbs重悬菌体，再用超声仪在4℃条件下破碎细胞，然后将大肠杆菌破碎产物在4℃、14000×g离心力下离心15分钟。(3)在步骤(2)收集的上清液中加入2ml聚乙烯亚胺(pei，10％)，再次离心15分钟，目的为除去细胞裂解液中的核酸及其他带负电物质，得到的上清液进行itc纯化：加入终浓度为3m的nacl，37℃充分溶解后14000×g离心力下离心15分钟，去上清，沉淀溶解在提前预冷的10mmpbs中，完全溶解后离心，得到上清。此过程重复2-3次即可获得样品。2、用ni亲和层析的方法来纯化带有his标签的ifn重组蛋白，具体步骤是：将上清用0.22μm滤膜过滤后，上样到镍亲和柱中，然后用aktapurifier10系统进行纯化，之后用0～100％缓冲液b(10mmpbs,500mm咪唑,ph7.4)进行梯度冲洗，收集各个洗脱峰，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行分析。得到目标蛋白后，用hiprep26/10脱盐柱去除咪唑，并置将缓冲液置换成10mmpbs，ph7.4，溶液中，保存在-80℃。纯化样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)测试纯度，并用分光光度计法(nanodrop2000)测定了蛋白的浓度。sds-page分析样品由含有5％β-巯基乙醇的laemmli样品缓冲液配制，浓度为1mg/ml，95℃下加热5min后，10μl样品装载到预制的10％sds-page凝胶中，垂直电泳80～100v电压下运行90min(电泳液为：25mmtris、250mmglycine、0.1％sds)。凝胶用考马斯蓝g-250染色处理后观察条带位置。图1显示了ifn-elp和ifn的表达与纯化。从左至右依次为ifn-elp(v)、ifn-elp(a)、蛋白标样、ifn，结果表明，通过大肠杆菌进行表达，纯化后获得纯度＞95％的蛋白，该蛋白即为ifn-elp融合蛋白。实施例3本实施例中，以实施例2获得的ifn-elp融合蛋白为样品，测量该样品的物理化学表征参数，具体如下：(1)用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(maldi-tof)测定实施例2获得纯化产物的分子量，所用仪器为4800plusmaldi-tof/toftm分析仪(absciex)，结果如图2所示，表明ifn-elp和ifn的实验所测分子量与理论值接近。(2)在malvernzetasizernano-zs90上用动态光散射(dls)方法测定ifn和ifn-elp的水合半径：样品稀释在pbs缓冲液中，测试前经0.22μm孔径滤膜过滤处理。经dls测试，ifn的水合半径为2.9nm，而合成的ifn-elp(v)和ifn-elp(a)的水合半径分别为11.1和12.8nm。而肾脏滤过清除尺寸约为5nm半径，表明elp融合可以延长ifn的循环半衰期，图3显示了dls分析ifn和ifn-elp的水合半径。(3)ifn-elp的二级结构用圆二色性谱分析测得：样品用水溶液稀释至0.15mg/ml，用pistarπ-180(appliedphotophysics有限公司)在200-250nm波长范围内进行紫外扫描分析，结果如图4所示，图4显示了圆二色性色谱分析ifn和ifn-elp的二级结构，均在200-260nm波长范围内的圆二色谱都呈现出同样的208/222nm双峰曲线，为典型的α螺旋结构，且与ifn曲线重叠良好，表明elp融合并没有干扰ifn的二级结构。(4)ifn-elp的相转变温度(tt)通过浊度法进行测定：样品用pbs稀释至1mg/ml，用酶标仪(moleculardevices)测定在4-80℃(以1℃/min递增)温度范围内od350的紫外吸收，再以同样速率降温至4℃测定od350的紫外吸收，其中，tt指样品浊度达到最大值一半时的温度，结果如图5所示，图5显示了ifn-elp和ifn的相转变温度，ifn-elp(v)的相变温度为23.5℃，ifn-elp(a)为63.5℃，二者都表现出急剧的可逆相转变行为。(5)为了探索ifn-elp相转变温度的浓度依赖性，ifn-elp样品用pbs稀释至不同浓度，用酶标仪(moleculardevices)测定在4-80℃(以2℃/min递增)温度范围内od350的紫外吸收，结果如图6所示，图6显示ifn-elp(v)的相变温度在高浓度时低于体温，而低浓度下高于体温，结果表明ifn-elp(v)高浓度皮下注射时，会从溶液中析出，原位形成储库，但是由于低浓度溶解效应会逐渐从储库释放扩散进入循环系统。虽然ifn-elp(a)的相变温度也有浓度依赖性，但当它的浓度达到500μm时相变温度仍远高于体温，表明ifn-elp(a)即使高浓度皮下注射也不会形成储库。实施例4本实施例中，对实施例2得到的ifn-elp融合蛋白的体外生物活性进行检测，其中，ifn-elp的抗细胞增殖活性采用mtt方法测定。mtt实验选用了人burkitt’sb淋巴瘤细胞(daudib)，因为该细胞对ifn-α2具有较高的敏感度。daudib细胞在含有10％fbs、50u/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的rmpi-1640中培养一段时间后，在96孔板中接种一定浓度的细胞悬浮液(50μl/孔，104个细胞)，将ifn和ifn-elp样品系列稀释，各50μl加入96孔培养板中，设阴性对照(不含ifn-α2)和空白对照(只含培养液)，37℃，5％co2培养72～96h，加mtt溶解液(promega)20μl/孔，3h后用酶标仪测定各孔490nm波长的吸收值，比较不同样品处理后细胞增值的程度。结果如图7和表1所示，结果显示了mtt测定ifn-elp的体外生物活性，其中，ifn-elp(v)、ifn-elp(a)和ifn的ic50分别为54.6pg/ml、56.9pg/ml和20.2pg/ml，ifn-elp(v)活性保持了37％，远远高于人白蛋白修饰的ifn的活性保持率(<1％)。该结果表明经温敏性elp修饰后并没有严重降低ifn的活性，为体内抗肿瘤活性测试提供了依据。表1样品ic50(pg/ml)相对活性(％)ifn20.2100ifn-elp(a)56.936ifn-elp(v)54.637实施例5本实施例中，对实施例2得到的ifn-elp融合蛋白的药物代谢动力学进行测试，具体如下：利用裸鼠模型经尾静脉注射低浓度0.1μm的ifn或ifn-elp后，测定了血液中干扰素浓度随时间变化的情况，并利用das软件进行数据分析。由图6可知，此浓度足够低以避免ifn-elp(v)在循环系统中的相转变。在药物处理期前，12只8周龄体重为20g左右的雌性裸鼠观察一段时间后，随机分成3组。以30μg/kg体重剂量尾静脉注射ifn-elp(v)、ifn-elp(a)和ifn，然后在设定的时间点用异氟烷对裸鼠进行麻醉后经眼内眦静脉取血0.3-0.4ml，室温静置1h，在4℃、3000×g下离心收集上层血清，保存于﹣80℃低温冰箱。用人ifn-α2elisa试剂盒(pblinterferonsource)根据说明书测定血清中的ifn-α2含量。利用das3.0药物代谢动力学分析软件计算出药物代谢动力学参数。利用das软件中房室消除模型分析ifn-elp和ifn的药物代谢动力学参数，ifn的清除速率(cl)(48.7±4.0ml/h)降低到了ifn-elp(v)的4.0±0ml/h和ifn-elp(a)的4.0±0ml/h。ifn的终末半衰期(t1/2β)(1.2±0.1h)延长到了ifn-elp(v)的9.9±0.2h和ifn-elp(a)的9.8±0.4h。ifn-elp(v)和ifn-elp(a)的曲线下面积(aucs)为150.4±8.7mg/l·h和147.1±7.5mg/l·h，分别为ifn(12.4±1.0mg/l·h)的12.1和11.9倍，结果详见图8，结果表明，由于尺寸增大和肾脏清除减弱，elp融合可显著提高ifn的药代动力学水平，这与其他延长半衰期的途径如peg化，hsa融合，fc融合和无规卷曲多肽融合的原理相同。但是，静脉注射融合蛋白后血药浓度降低的结果显示，静脉注射溶解状态ifn-elp以延长半衰期的方法并不能消除药代的峰谷波动效应。为了克服这个挑战，以最大耐受剂量皮下注射了ifn-elp(v)和ifn-elp(a)。图9显示，ifn-elp(v)的最大耐受剂量(100mg/kg体重(bw))是ifn-elp(a)(25mg/kgbw)和ifn(15mg/kgbw)的4.0和6.7倍。而且，按最大耐受剂量第二次皮下给药，ifn-elp(v)可耐受但ifn-elp(a)和ifn则无法耐受。表明温敏性的elp融合蛋白可显著提高药物耐受度。由图6可知，最大耐受剂量的ifn-elp(v)和ifn-elp(a)相变温度分别大大低于和高于体温。因此，以最大耐受剂量皮下一次注射ifn-elp(v)会在原位形成一个储库，正如图10所示在原位形成了一个可持续一个月的肿块，而ifn-elp(a)90则不能形成储库。以最大耐受剂量皮下注射ifn-elp(v)、ifn-elp(a)和ifn，并按同上方法分析药物代谢动力学参数，图11显示，经过皮下注射，ifn和ifn-elp(a)组血液中ifn水平很快于2.7±1.2h和4±0h提高到5457±759μg/l和6131±262μg/l，之后快速下降，表现出药代动力学的峰谷变化。相反，皮下注射ifn-elp(v)组的ifn血药浓度在13.3±9.2h达到5461±559μg/l后，在30天内维持几乎稳定的水平，表现出持续一个月的零级稳定释放。这种及其显著的差异可由表3中ifn，ifn-elp(a)和ifn-elp(v)的药代动力学参数进一步证明。ifn-elp(v)的半衰期(497.2±57.0h)分别是ifn-elp(a)(10.5±1.5h)和ifn(1.9±0.13h)的47.4和261.7倍，表明将延长半衰期与温敏性可控释放相结合有效提高了ifn的半衰期。ifn-elp(v)组的药时曲线面积(3176±247mg/l·h)分别是ifn-elp(a)(135.4±10.2mg/l·h)和ifn(45.1±7.1mg/l·h)的23.5和70.4倍，表明温敏性elp融合极大提高了药物的生物利用度。而且，由图12可知，ifn-elp(v)在血液循环系统中累积的药时曲线面积与时间呈线性相关，证实了ifn-elp(v)满足一个月的零级持续释放，而ifn-elp(a)和ifn呈对数释放曲线。综上所述，这些结果证明了温敏性的elp融合可在为期一个月的相当长的时期消除ifn药代动力学的峰谷波动效应。表2显示了低浓度0.1μm尾静脉注射ifn-elp的药物代谢动力学数据分析。表3显示了最大耐受剂量皮下注射ifn-elp的药物代谢动力学数据分析。表2参数ifnifn-elp(a)ifn-elp(v)t1/2β(h)1.2±0.089.8±0.49.9±0.24mrt0-∞(h)0.8±0.211.7±0.7312.6±1.2auc(mg/l·h)12.4±1.01147.1±7.5150.4±8.7cl(ml/h)48.7±4.04.0±04.0±0表3实施例6本实施例中，研究实施例2得到的ifn-elp融合蛋白在组织中的分布情况，具体如下：利用移植了卵巢癌细胞的裸鼠测定了一次皮下注射最大耐受剂量，给药24h，72h，30d后各主要组织器官中残留的干扰素的浓度。将12只雌性无胸腺(nude)裸鼠分成3组，ifn组、ifn-elp(a)和ifn-elp(v)组，人卵巢癌细胞(ovcar-3)在含有10％fbs，50u/ml盘尼西林和50μg/ml链霉素的rmpi-1640培养基中培养一段时间后，用胰蛋白酶消化剥离，经pbs洗涤，重悬于不含上述添加物的rmpi-1640培养基，0.2ml单细胞悬液(5×106个细胞)接种于裸鼠左后肢股骨处背部皮下，培养30天后形成100mm3大小的实体瘤肿块。ifn-elp和ifn以最大耐受剂量背部皮下注射，给药24h，72h，30d后分别处死裸鼠，收集主要器官如心、肾、肝脏、脾脏、肺、胰腺、胃、肌肉、小肠及肿瘤。组织用提取缓冲液(pbs含1mmedta，0.5％tritonx-100，0.5％脱氧胆酸钠，1mmpmsf，按1:100比例稀释的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物(sigma-aldrich))破碎后，离心取上清提取液。组织中的ifn的浓度用elisa方法定量测定。检测结果如图13所示，图13显示了ifn-elp在各组织中累积情况。在注射样品24h，72h，30d后，ifn-elp在各组织中能够有效累积。ifn-elp(v)主要在肿瘤和肾脏中有高浓度，即使在给药后30天也是如此。这是由于存在一个月的零级持续释放动力学。与之相反，ifn-elp(a)和ifn在肿瘤中聚集量较少，并且按最大耐受剂量给药后72h在所有主要组织器官中都几乎检测不到了，这是由于它们循环半衰期短。这些结果表明温敏性elp融合大大提高了ifn在小鼠体内的生物分布。从而提高干扰素在体内的生物利用度和抗肿瘤功效。实施例7本实施例中，利用裸鼠模型测试实施例2得到的ifn-elp的体内抗肿瘤活性，本实施例采用ovcar-3卵巢癌细胞和c8161黑色素瘤细胞在裸鼠皮下肿瘤模型来评价ifn-elp的体内生物活性。将ovcar-3或c8161细胞接种于裸鼠右后肢股骨处背部皮下，培养～30天后形成实体瘤肿块(～30mm3)，从而建立裸鼠肿瘤模型。将40只裸鼠分成4组，ifn-elp(v)组、ifn-elp(a)组、ifn组和生理盐水组。以最大耐受剂量一次背部皮下注射打入裸鼠体内，直至对照组小鼠全部死亡。每周观察裸鼠生存状态以及肿瘤生长情况，动态测量裸鼠体重和肿瘤体积随时间的变化。治疗结束后通过眼球取血，获得血液和血清送至清华大学校医院检验科测定乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等基本生理指标水平。当小鼠肿瘤生长超过1000mm3或体重下降超过15％，小鼠即安乐处死。其中，图14,15显示，对于卵巢癌模型，经一次皮下注射最大耐受剂量，ifn-elp(v)组的所有10只小鼠肿瘤减小并在给药后15天消失，均未见复发。相反，皮下注射最大耐受剂量的ifn-elp(a)和ifn组小鼠肿瘤分别于第6天减小到了13.7±6.5mm3和18.1±8.6mm3，但是又逐渐增大到了第36天的507.6±149.6mm3和922.2±332.0mm3。图16显示，ifn-elp(a)和ifn组小鼠中值生存时间分别为39和30天，是生理盐水组小鼠(24d)的1.6和1.3倍。与之相反，ifn-elp(v)组未见小鼠死亡。同样，对于黑色素瘤模型也取得了相似的结果，图14显示，ifn-elp(v)的治疗效果大大优于ifn-elp(a)和ifn，经一次皮下注射最大耐受剂量，ifn-elp(v)组的33％的小鼠肿瘤被治愈，均未见复发。图16显示，ifn-elp(a)和ifn组小鼠中值生存时间分别为27和22.5天，是生理盐水组小鼠(21d)的1.3和1.1倍。与之相比，由于33％的小鼠肿瘤被治愈，ifn-elp(v)组大大延长了生存时间，综上所述，这些体内抗肿瘤数据表明温敏性elp融合可以显著提高ifn在小鼠体内的药效动力学表现。能够有效地治愈或抑制肿瘤的生长，具有非常好的体内抗肿瘤活性。图14显示了ifn-elp抑制肿瘤生长情况，图15为小鼠肿瘤生长实物图，图16显示了注射药物后小鼠的生存曲线。图17显示，所有组裸鼠都没有观察到明显的体重变化，表明ifn-elp没有明显的副作用。图18h&e染色表明ifn-elp(v)和ifn-elp(a)对主要器官如心、肝、脾、肺、肾都没有引起明显的组织学改变，而ifn引起了肾脏损伤，表现为广泛性的肾小管颗粒变性和肾间隙水肿。表明ifn-elp不会对体内器官造成明显毒性，为未来用于临床使用提供了基础。图19血液生化分析进一步证实了上述结果，其中ifn组的肾功能标志物如肌酸酐(crea)和血液尿素氮(urea)显著高于生理盐水组。与生理盐水组相比，ifn-elp(v),ifn-elp(a)和ifn都没有引起所有血常规标志物水平的显著变化。而且，图20显示所有组都没有表现出溶血反应。这些数据表明温敏性elp融合可以降低ifn对小鼠的系统毒性。图17显示了注射药物后裸鼠体重随时间的变化情况。图18显示了注射药物后裸鼠各主要器官组织学改变。图19显示了小鼠注射药物后心脏(乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶)、肝(谷丙转氨酶、谷草转氨酶)、肾(肌酐、尿素氮)功能生理指标变化情况和血液指标(红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白)变化情况。图20显示了ifn-elp(v),ifn-elp(a)和ifn的溶血情况。综上所述，本发明实施例创新性地提出了一种温敏性长效缓释药物载体，通过整合半衰期延长和温敏性可控释放，大大提高循环半衰期短的药用蛋白的药代动力学性能。给小鼠一次皮下注射温敏性ifn-elp融合蛋白显示出大大延长的持续一个月的零级释放动力学，这是目前可知的蛋白递送系统所达到的最长的循环时间。基于应用一个与体重相关的动力学方程推导出的异速生长缩放比例，小鼠药代动力学数据表明温敏性elp融合可以实现人的每三个月给药一次的剂量。因此，一次性皮下注射温敏性ifn-elp融合蛋白表现出大大增强的肿瘤聚集并根治肿瘤，而且显著提高了小鼠的耐受性和生物安全性。这种温敏性缓释药物载体适用于很多药用蛋白，不仅可减少给药频率，还可极大提高治疗效果，同时降低毒副作用，从而大大提高患者的生活质量。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页12