本发明属于植物活性物质提取方法及应用领域，具体涉及一种圆齿野鸦椿提取物在抗肝损伤药物中的应用。
背景技术
肝脏是人体最大的器官，是人体内以代谢功能为主的器官，同时也肩负着消化和解毒的功能。我国是肝病大国，其中乙型肝炎病毒（hbv）携带者约1.2亿人，占全球hbv感染人数的1/3，其中慢性乙型肝炎病人约3000万，约10%-20%将发展为肝硬化，1%-5%将演变为肝癌，不仅严重影响人们的健康，也成为日益严峻的社会问题。肝脏损伤可由病毒感染、过度饮酒、药物滥用及自身免疫疾病等引起，是引起肝脏发病率和死亡率的重要原因之一。氧化应激是肝病发病主要的生理基础。当机体受到病毒、酒精、药物等损害因素的损伤时，机体内产生大量的反应性氧化产物（ros），当ros及其代谢的产物超过了机体的防御或去毒能力则使机体产生氧化应激状态。肝脏中含有丰富的线粒体，线粒体是ros产生的重要场所，因此肝脏很容易遭到ros的攻击而导致肝损伤。目前临床上常以酒精、四氯化碳（ccl4）和卡介苗（bcg）/脂多糖（lps）等诱导小鼠产生肝损伤，其病理改变与酒精、药物和病毒性肝炎的肝损伤机制相似，是筛选保肝药物的经典模型。
《中国植物志》记载我国有2种省沽油科野鸦椿属植物，为野鸦椿[euscaphisjaponica(thunb.)dippel]和福建野鸦椿（又名圆齿野鸦椿，euscaphiskonishiihayata）。野鸦椿是传统的中草药，主要治疗胃痛、跌打损伤、风湿疼痛、眩晕、泻疾、痢疾等，而圆齿野鸦椿主要用于观赏植物，目前对其药用价值研究较少，两者为同一属的两种植物。我们将圆齿野鸦椿提取物分别对酒精、四氯化碳（ccl4）和卡介苗（bcg）/脂多糖（lps）诱导的肝损伤小鼠进行给药，发现圆齿野鸦椿提取物均能显著改善小鼠的肝损伤症状，可用于肝损伤的预防和治疗。目前肝损伤的临床治疗还缺乏特效药物，本发明提供了圆齿野鸦椿提取物制备抗肝损伤药物的用途具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种圆齿野鸦椿提取物在制备预防和/或治疗肝损伤的药物中的应用。
一种圆齿野鸦椿提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）取干燥的圆齿野鸦椿植物体，切碎，50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿植物体粉末；
（2）向圆齿野鸦椿植物体粉末中加入5-20倍体积蒸馏水，加热至50-95℃回流提取3次，每次提取1-3小时，合并提取液；
（3）步骤（2）合并的提取液以等体积石油醚连续萃取3次，取下层的水相；
（4）步骤（3）所得水相上聚酰胺柱，先用水洗去未吸附的成分，再用体积百分浓度为70%的乙醇洗脱。
（5）步骤（4）所得乙醇洗脱液合并，在60℃下减压浓缩，并进行冷冻干燥，即得圆齿野鸦椿提取物。
上述圆齿野鸦椿植物体是圆齿野鸦椿枝、叶、根、花、种子、种皮、果实及果皮中的任意一种或多种。
上述肝损伤包括酒精性肝损伤，化学性肝损伤，免疫性肝损伤，但不仅限于以上肝损伤类型。
上述预防和/或治疗肝损伤的药物含有上述方法制备所得的圆齿野鸦椿提取物。
本发明的有益效果在于：
本发明的圆齿野鸦椿提取物，可降低肝损伤小鼠血清中谷草转氨酶（ast）和丙转氨酶（alt）含量，提高肝组织中的丙二醛（mda）、超氧化物歧化酶（sod）和谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px）含量，减轻肝损伤的症状，能应用于制备预防和/或治疗肝损伤的药物中。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
下述实验用圆齿野鸦椿（euscaphiskonishii）来源于福建省邵武市天成岩。
实施例1
一种圆齿野鸦椿提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）取干燥的圆齿野鸦椿果皮，切碎，50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿果皮粉末；
（2）向圆齿野鸦椿果皮粉末中加入5倍体积的蒸馏水，加热至95℃回流提取3次，每次提取1小时，合并提取液；
（3）步骤（2）合并的提取液以等体积石油醚连续萃取3次，取下层的水相；
（4）步骤（3）所得水相上聚酰胺柱，先用水洗去未吸附的成分，再用体积百分浓度为70%的乙醇洗脱。
（5）步骤（4）所得乙醇洗脱液合并，在60℃下减压浓缩除去乙醇，并进行冷冻干燥，即得圆齿野鸦椿果皮提取物。
实施例2
一种圆齿野鸦椿提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）取干燥的圆齿野鸦椿枝条，切碎，50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿枝条粉末；
（2）向圆齿野鸦椿枝条粉末中加入10倍体积的蒸馏水，加热至80℃回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液；
（3）步骤（2）合并的提取液以等体积石油醚连续萃取3次，取下层的水相；
（4）步骤（3）所得水相上聚酰胺柱，先用水洗去未吸附的成分，再用体积百分浓度为70%的乙醇洗脱。
（5）步骤（4）所得乙醇洗脱液合并，在60℃下减压浓缩除去乙醇，1并进行冷冻干燥，即得圆齿野鸦椿枝条提取物。
实施例3
一种圆齿野鸦椿提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）取干燥的圆齿野鸦椿叶片，切碎，50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿叶片粉末；
（2）向圆齿野鸦椿叶片粉末中入10倍体积的蒸馏水，加热至80℃回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液；
（3）步骤（2）合并的提液以等体积石油醚连续萃取3次，取下层的水相；
（4）步骤（3）所得水相上聚酰胺柱，先用水洗去未吸附的成分，再用体积百分浓度为70%的乙醇洗脱。
（5）步骤（4）所得乙醇洗脱液合并，在60℃下减压浓缩除去乙醇，并进行冷冻干燥，即得圆齿野鸦椿叶片提取物。
实施例4
一种圆齿野鸦椿提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）取干燥的圆齿野鸦椿种子，切碎，50℃烘干，粉碎得到圆齿野鸦椿种子粉末；
（2）向圆齿野鸦椿种子粉末中加入10倍体积的蒸馏水，加热至80℃回流提取3次，每次提取2小时，合并提取液；
（3）步骤（2）合并的提取液以等体积石油醚连续萃取3次，取下层的水相；
（4）步骤（3）所得水相上聚酰胺柱，先用水洗去未吸附的成分，再用体积百分浓度为70%的乙醇洗脱。
（5）步骤（4）所得乙醇洗脱液合并，在60℃下减压浓缩除去乙醇，并进行冷冻干燥，即得圆齿野鸦椿种子提取物。
实施例5【药效学实验】
（一）圆齿野鸦椿提取物对酒精引起的肝损伤动物模型的影响
取实施例1至实施例5中制备所得的圆齿野鸦椿提取物，加入到质量百分浓度为0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中配制成圆齿野鸦椿提取物含量为100mg/ml的药物备用。
采用56度红星二锅头（北京红星股份有限公司）连续灌胃15天，诱导小鼠产生酒精性肝损伤，建立小鼠酒精引起的肝损伤动物模型，以此模型研究圆齿野鸦椿提取物体外抗肝损伤的效果。
具体实验方法如下：
取70只昆明种小鼠，雌雄各半，体重（20±2）g，雄性和雌性小鼠分别随机分为7组，每组10只，包含5只雄性小鼠和5只雌性小鼠，分别为正常对照组、模型组、联苯双酯组、圆齿野鸦椿果皮提取物组、圆齿野鸦椿枝条提取物组、圆齿野鸦椿叶片提取物组和圆齿野鸦椿种子提取物组。除正常对照组外，其余各组每天灌胃56度二锅头白酒0.1ml/10g。白酒灌胃2h后，正常对照组及模型组给予生理盐水0.1ml/10g；联苯双酯组给予联苯双酯0.1ml/10g；其余各组给予含圆齿野鸦椿提取物的药物均为0.1ml/10g，每日1次，连续15天；每3天测量一次体重。末次给药1-2h后，各组小鼠禁食不禁水16h。称取各组小鼠体重并记录，摘除眼球取血，颈椎脱臼处死动物，立即摘取肝脏标本进行有关检测。
（二）圆齿野鸦椿提取物对ccl4引起的肝损伤动物模型的影响
取实施例1至实施例4中制备所得的圆齿野鸦椿果皮提取物，加入到质量百分浓度为0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中配制成圆齿野鸦椿提取物含量为100mg/ml的药物备用。
采用体积百分浓度为30%ccl4花生油溶液腹腔注射诱导小鼠产生药物性肝损伤，建立小鼠ccl4引起的肝损伤动物模型，以此模型研究圆齿野鸦椿提取物的体外抗肝损伤的效果。
具体实验方法如下：
取70只昆明种小鼠，雌雄各半，体重（20±2）g，雄性和雌性小鼠分别随机分为7组，每组10只，包含5只雄性小鼠和5只雌性小鼠，分别为正常对照组、模型组、联苯双酯组、圆齿野鸦椿果皮提取物组、圆齿野鸦椿枝条提取物组、圆齿野鸦椿叶片提取物组和圆齿野鸦椿种子提取物组。除正常对照组外，其余各组每隔3天腹腔注射体积百分浓度为30%ccl4花生油0.05ml/10g。正常对照组及模型组给予生理盐水0.1ml/10g，联苯双酯组给予联苯双酯0.1ml/10g，其余各组给予含圆齿野鸦椿提取物的药物均为0.1ml/10g，每日1次，连续15天。每3天测量一次体重。末次给药1-2h后，各组小鼠禁食不禁水16h。称取各组小鼠体重并记录，摘除眼球取血，颈椎脱臼处死动物，立即摘取肝脏标本进行有关检测。
（三）圆齿野鸦椿提取物对卡介苗-脂多糖（bcg/lps）引起的肝损伤动物模型的影响
取实施例1至实施例4中制备所得的圆齿野鸦椿提取物，加入到质量百分浓度为0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中配制成圆齿野鸦椿提取物含量为100mg/ml的药物备用。
采用bcg/lps联合诱导小鼠产生免疫性肝损伤，建立bcg/lps引起的肝损伤动物模型，以此模型研究圆齿野鸦椿提取物的体外抗肝损伤的效果。
具体实验方法如下：
取70只昆明种小鼠，雌雄各半，体重（20±2）g，雄性和雌性小鼠分别随机分为7组，每组10只，包含5只雄性小鼠和5只雌性小鼠，分别为正常对照组、模型组、联苯双酯组、圆齿野鸦椿果皮提取物组、圆齿野鸦椿枝条提取物组、圆齿野鸦椿叶片提取物组和圆齿野鸦椿种子提取物组。除正常对照组外，其余各组第1天经小鼠尾静脉注射bcg2.5mg/0.2ml/只（约含5.0×107个活菌数），预先致敏。在bcg致敏后第2天开始，正常对照组及模型组给予生理盐水0.1ml/10g，联苯双酯组给予联苯双酯0.1ml/10g，其余各组给予含圆齿野鸦椿提取物的药物均为0.1ml/10g，每日1次，连续15天，每3天测量一次体重。末次给药1-2h后，除正常对照组外，其余各处理组均尾静脉注射lps7.5μg/0.2ml/只进行免疫性肝损伤。注射lps后，禁食不禁水16h。称取各组小鼠体重并记录，摘除眼球取血，颈椎脱臼处死动物，立即摘取肝脏标本进行有关检测。
（四）指标测定
小鼠全血用质量百分浓度为1%的肝素钠包被过的ep管收集，静置45min后，以1500转/min离心10min后取血清，以全自动生化分析仪检测血清中的alt和ast含量。取小鼠肝脏同一部位组织，准确称重0.4g，将组织和4℃的生理盐水按1：9的比例匀浆。按照试剂盒说明进行丙二醛（mda）、超氧化物歧化酶（sod）和谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px）的检测。
（五）统计学方法
使用spss21.0对实验数据进行one-wayanova统计学分析，结果以
（六）实验结果
1、圆齿野鸦椿提取物对酒精性肝损伤小鼠血清的影响
与正常组相比，模型组小鼠血清alt和ast活性显著增高（p<0.01），说明模型建立成功。与模型组相比，圆齿野鸦椿各提取物组及阳性对照联苯双酯组均能显著降低酒精性肝损伤小鼠血清的alt和ast活性，差异具有统计学意义，实验结果见表1。与模型组相比较，圆齿野鸦椿各提取物组及阳性对照联苯双酯组可显著抑制小鼠肝组织中的mda含量（p＜0.01），并显著提高sod和gsh-px活性，差异具有统计学意义，实验结果见表2。
表1圆齿野鸦椿提取物对酒精性肝损伤小鼠血清alt和ast活性的影响（
注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
表2圆齿野鸦椿提取物对酒精性肝损伤小鼠肝组织sod、mda及gsh-px含量的影响（
注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01.
2、圆齿野鸦椿提取物对ccl4诱导化学性肝损伤小鼠的影响
与正常组相比，模型组小鼠血清alt和ast活性显著增高（p<0.01），说明造模成功。与模型组相比，圆齿野鸦椿各提取物组及阳性对联苯双酯组均能显著降低ccl4诱导肝损伤小鼠血清的alt和ast活性，差异具有统计学意义，实验结果见表3。与模型组相比较，圆齿野鸦椿各提取物组及阳性对照联苯双酯组可显著提高sod和gsh-px活性，抑制小鼠肝组织mda含量（p＜0.01），并差异具有统计学意义，实验结果见表4。
表3圆齿野鸦椿提取物ccl4诱导的肝损伤小鼠血清alt和ast活性的影响（
注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
表4圆齿野鸦椿提取物对ccl4诱导的肝损伤小鼠肝组织sod、mda及gsh-px含量的影响（
注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01.
3、圆齿野鸦椿提取物对bcg/lps诱导免疫性肝损伤小鼠的影响
与正常组相比，模型组小鼠血清alt和ast活性显著增高（p<0.01），说明造模成功。与模型组相比，圆齿野鸦椿各提取物组及阳性对照联苯双酯组均能显著降低bcg/lps诱导肝损伤小鼠血清的alt和ast活性，差异具有统计学意义，实验结果见表5。与模型组相比较，圆齿野鸦椿各提取物组及阳性对照联苯双酯组可显著提高sod和gsh-px活性，抑制小鼠肝组织mda含量（p＜0.01），并差异具有统计学意义，实验结果见表6。
表5圆齿野鸦椿提取物对bcg/lps诱导肝损伤小鼠血清alt和ast活性的影响（
注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
表6圆齿野鸦椿提取物对bcg/lps诱导肝损伤小鼠肝组织no、sod、mda及gsh-px含量的影响（
注：与正常组比较，#p＜0.05，##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01.
（六）结论
圆齿野鸦椿提取物能明显改善酒精、ccl4和bcg/lps诱导的小鼠肝损伤，圆齿野鸦椿提取物能够应用于制备预防和/或治疗肝损伤的药物中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。