一种防治肺损伤的干细胞来源的外泌体制剂的制作方法

本发明涉及利用干细胞来源的外泌体制剂增强其在肺部组织损伤中的治疗效果，属于干细胞治疗与再生医学
技术领域：
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背景技术：
干细胞是一类具有多向分化能力的多能性细胞。人间重质干细胞来源于发育早期中胚层的一类异质性多能干细胞，在骨髓、脂肪、脐带、胎盘等多种组织中分布存在。人间重质干细胞高表达cd105、cd90、cd73、cd44低表达cd45、cd34、cd14、cd79α和人类白细胞抗原。人来源的间充质干细胞可以在体外定向分化为多种细胞如：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。间充质干细胞低表达主要组织相容性复合体、fas配体、共刺激分子等，因而可以产生较低的免疫反应。人尿液中存在丰富的干细胞，主要来源于肾细胞。尿液干细胞高表达cd224、cd146、血小板生长因子γβ（platelet-derivedgrowthfactorγbeta，pdgf-γβ）以及神经/胶质抗原2（neural/glialantigen2,ng2）。内皮祖细胞主要从外周血分离，呈现造血或非造血祖细胞前体的异质性。内皮祖细胞表面标记物为cd133、cd34和vegfr2；内皮祖细胞抗原分化成成熟的内皮细胞并分泌促进血管新生的因子，促进血管损伤的修复。干细胞在组织损伤修复中发挥着重要作用，目前认为，该作用的发挥主要通过旁分泌机制进行，而旁分泌的主要物质为外泌体。外泌体是细胞旁分泌成分的主要形式，在细胞间通讯中起着十分重要的作用。干细胞内部的多囊泡，向外出芽产生30-200nm的微小囊泡即为外泌体。外泌体内包含干细胞内dna、rna、microrna以及蛋白质等具有生物活性和治疗效果的分子。外泌体通过外泌体可以通过与靶细胞膜表面受体结合，触发靶细胞内的信号转导通路，并进一步调节靶细胞内的生物学过程；外泌体还可以通过内吞或胞饮作用被靶细胞内在化；外泌体还可以通过与靶细胞膜融合，直接将外泌体内携带的活性物质递送到靶细胞内。外泌体介导的细胞间通讯可以为邻近细胞提供大量的生物活性材料及信号分子，这项功能不能被简单的可溶性旁分泌因子所取代，可以为细胞内蛋白质及遗传物质的水平转移提供有效的转移途径。肺损伤包括急性肺损伤、放射诱导的肺损伤、肺纤维化以及矽肺等。急性肺损伤是危重病人常见的临床综合症，死亡率高达40%左右，其发病机制主要是多种炎症细胞如：中性粒细胞、巨噬细胞等释放炎症因子，从而导致肺微血管通透性增加和肺水肿。临床上并无很好的治疗药物。研究表明，通过抑制中性粒细胞的活化，抑制成纤维细胞增殖以及胶原的沉积可以改善急性肺损伤。放射肺损伤为胸部肿瘤放射后导致的肺部损伤，肺损伤主要机制为：射线照射导致肺损伤主要表现为肺部内皮细胞和肺泡细胞损伤；放射肺损伤进展为肺炎和肺纤维化，严重影响胸部肿瘤患者的放射剂量和生存质量。肺纤维化是由多种原因诱导的慢性间质性肺部疾病，肺纤维化严重影响病人的生命健康和生存质量。目前，临床上并未有很好的治疗方式。干细胞如间充质干细胞具有显著的抗炎和组织修复功能；目前普遍认为干细胞的治疗效果主要来源于旁分泌机制及外泌体。而外泌体作为非细胞制剂在组织修复中有着比干细胞更为广泛的应用，为组织损伤修复以及非细胞治疗提供了新的思路和方法。技术实现要素：本发明是一种防治肺部组织损伤的干细胞来源的外泌体制剂。该发明是一种干细胞来源的外泌体制剂，该制剂通过尾静脉注射或者肺部气管灌注的方法递送至肺部损伤部位或炎症部位，从而达到改善肺部损伤的效果。所述外泌体为干细胞来源的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、或心脏干细胞等。本发明可以有效增强肺部损伤后的治疗效果，外泌体中的有效分子到达肺部后，可以与受损的肺部细胞相互作用，释放具有生物活性和治疗效果的分子，促进损伤组织结构和功能的恢复。所述肺部组织损伤包括急性肺损伤、放射肺损伤、肺纤维化及矽肺等。附图说明图1a为外泌体粒径大小分析；图1b为外泌体表面蛋白鉴定；图1c为外泌体电镜鉴定，该外泌体为间充质干细胞分泌的外泌体。图2为间充质干细胞来源的外泌体促进放射诱导的肺损伤组织结构和功能修复。图2a为h&e染色显示外泌体治疗组组织结构恢复；图2b为放射后masson染色，显示放射后肺纤维程度；图2c为肺部呼吸面积统计和肺灌洗液总蛋白以及细胞计数，显示干细胞来源的外泌体制剂治疗后，损伤肺部水肿、炎症反应等都得到了改善。图3为间充质干细胞来源的外泌体制剂促进大肠杆菌诱导的急性肺损伤组织结构和功能修复情况。图3a为h&e染色显示外泌体制剂治疗组组织结构恢复；图3b、3c、3d为肺部呼吸面积检测和组织面积检测以及肺部组织的湿重干种比值，显示外泌体制剂治疗后对肺部水肿情况的改善。图4为间充质干细胞来源的外泌体改善放射诱导的肺损伤炎症因子基因表达情况。具体实施方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。实施例1，本发明提供一种干细胞来源的外泌体制剂的制备方法。细胞培养基、青霉素/链霉素、胰酶、丙酮酸钠、谷氨酰胺等试剂均购于gibco公司；细胞培养所需培养瓶、孔板等均购于corning公司。细胞培养所用血清为hyclone,血清浓度为10%。细胞复苏、培养、传代、冻存等细胞学常见操作步骤参考《动物细胞培养（第六版）》。无外泌体血清制备：胎牛血清于120，000g，4℃离心2h，提取上清（外泌体为沉淀），并用0.22μm的滤器过滤除菌，配制为终浓度为10%培养基备用。外泌体条件培养基收集：干细胞培养，生长到80%时，去除培养基，并用pbs清洗两次，清洗后采用去除外泌体的条件培养基进行培养，培养24小时后收集培养基进行外泌体的提取。外泌体提取（梯度离心法）：条件培养基上清一次离心4℃，300g离心10min；4℃，12000g离心20min；去除细胞碎片和凋亡小体；用0.22μm的滤器过滤上清，去除直径大于200nm的微囊泡；过滤后的上清置于超速离心管中，4℃，100，000g离心70min；得到外泌体沉淀，并用pbs重悬，待用。外泌体蛋白定量分析：外泌体蛋白定量采用bca蛋白定量试剂盒（康为试剂）进行定量，实验方法如下：（1）工作液的配制表1蛋白标准品配制管号稀释液体积（μl）标准品体积（μl）终浓度（ug/ml）a240602000b3090(从a管取)1500c6060(从a管取)1000d6060(从b管取)750e6060(从c管取)500f6060(从e管取)250g6060(从f管取)125h10025(从g管取)25i6000(空白孔)（2）将25μl标准品和稀释后的外泌体（5μl外泌体加20μl双蒸水）分别加入到96孔板中。（4）每孔加入200μlbca混合均匀的工作液（a液：b液=50：1）。（5）37℃恒温水浴锅孵育30min。（6）冷却到室温后，用酶标仪（thermo）测定在a562时的吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度。（7）用pbs将外泌体终浓度调整为1μg/μl。实施例2，本发明提供一种干细胞来源的外泌体制剂的鉴定方法。外泌体粒径大小分析：将上述浓度调整好的外泌体用纯水稀释400倍，然后采用纳米颗粒跟踪分析仪对悬浮的外泌体进行逐个分析和成像，分析结果如图1a。干细胞来源的外泌体粒径大小0-200nm，平均粒径大小为120nm。外泌体表面蛋白表达分析：通过westernblot对外泌体表面蛋白标记进行检测，实验步骤如下：（1）蛋白样品制备：向上述定量好的外泌体中加入5×上样缓冲液(康为试剂)，沸水水浴10分钟，保存于-80℃。（2）聚丙烯酰胺电泳分离胶配制清洗长短玻璃板以及制备胶片所需的梳子，然后安装在制胶器上检测是否漏水。最后按照下面表格的配方进行配制分离胶。表2分离胶配方采用10%分离胶进行制胶，混匀后将分离胶加入玻璃板间隙中，胶液面具短玻璃板上沿3.5厘米左右，最后加入蒸馏水压平胶面。待胶凝结后，倒去蒸馏水，并用滤纸吸去多余蒸馏水备用。（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶配制按照下列组分比例配置5ml所需浓度的浓缩胶，将凝胶灌入到玻璃板之间，插入“梳子”，室温聚合。表3浓缩胶配方各种组分名称取样量无离子水3.4ml30%丙烯酰胺0.83ml1.0mtris-hcl缓冲液0.63ml10%sds0.05ml10%ap0.05mltemed5.0μl（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳待胶凝好后，短板朝里，长板朝外，放置到电泳槽中，并加入电泳缓冲液。加入制备好的蛋白样品，60v电压压缩，待样品进入分离胶后调整电压为120v电泳。（5）转膜待溴酚蓝电泳到最底部时，终止电泳，取出胶板。保鲜盒中倒入预冷的转膜液，转膜夹板黑色面朝下放置，并依次从下往上放入海绵、滤纸、聚丙烯酰胺凝胶。用无水甲醇激活pvdf膜，然后放置在凝胶上面，并赶走凝胶与膜之间的气泡。再依次加入海绵和滤纸，并夹好转膜夹板。夹板按照黑对黑的原则放入转膜槽中，加入预冷的转膜液和冰袋，安装好电极。将电泳装置置于冰中进行电泳，电泳条件为100v，60min。（6）封闭转膜结束后，用tbst配制的5%脱脂牛奶进行封闭，摇床上封闭2h。（7）一抗封闭：将封闭好的膜进行裁剪，加入稀释好的抗体，于4℃过夜孵育。孵育过夜后，回收一抗，并用tbst清洗3次，每次10min。（8）加入5%脱脂牛奶稀释的二抗（1:5000），室温孵育2h，tbst清洗3次，每次10min。（9）曝光暗盒底部铺平保鲜膜，滤纸吸去蛋白膜表面多余水分后转移置暗盒，加入化学发光底物，覆盖好保鲜膜。放置胶片来对蛋白进行显影。扫描后得到蛋白表达条带图，如图1b。外泌体透射电镜形态分析：将外泌体滴于200目的铜网上，室温静止2min，用滤纸吸去多余液体。再滴加20mg/ml醋酸铀负染，室温静置1min，用滤纸吸去多余液体。晾干后于透射电镜下进行观察，并采集图片。如图1c所示，外泌体为杯状囊泡样结构，直径约为100nm左右。实施例3，本发明提供小鼠急性肺损伤、放射肺损伤、肺纤维化以及矽肺等肺损伤模型的构建方法。小鼠急性肺损伤构建：小鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛（330mg/kg）麻醉小鼠；将麻醉后的小鼠进行仰位固定，四肢和头部牙齿固定；冷光源灯从胸部和颈部之间进行照射；镊子牵引出舌头，暴露口腔；用棉签擦去口腔内唾液，通过调整光源位置，可以看到会咽部张合运动，中间透亮小点即为气管入口；采用22g套管进行插管；插管后注入108cfu大肠杆菌（溶于100μlpbs）。未处理组作为正常对照组，手术后动物随机分为2组：pbs组，干细胞外泌体（exo）治疗组。小鼠放射肺损伤模型构建：小鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛（330mg/kg）麻醉小鼠；麻醉后的小鼠进行胸部暴露照射，照射源为gc40ew/2c-440γ射线，照射剂量为15gy。为处理组作为正常对照组，处理组随机分成两组：pbs组、干细胞来源的外泌体治疗组。小鼠肺纤维化模型构建：小鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛（330mg/kg）麻醉小鼠；麻醉后的小鼠仰卧于小鼠固定台上，对四肢和头部牙齿进行固定。冷光源灯从小鼠胸部和颈部之间进行照射；牵引出舌头，暴露口腔；用棉签擦去口腔内唾液，调整光源找到气管亮点，采用22g套管插管；气管插管注射5mg/kg的博来霉素（溶于100μl生理盐水）诱导肺纤维化模型。气管内注射100μl生理盐水作为对照组，处理组随机分成两组：pbs组和干细胞来源的外泌体组。小鼠矽肺模型构建：小鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛（330mg/kg）麻醉小鼠；麻醉后的小鼠仰卧于小鼠固定台上，对四肢和头部牙齿进行固定。对小鼠采取气管插管，一次性气管内注射二氧化硅悬液50μl（105mg/l）建立矽肺损伤模型。气管内注射50μl生理盐水作为对照组；处理组随机分成两组：pbs组和干细胞来源的外泌体治疗组。实施例4，本发明提供干细胞来源的外泌体制剂注射方法尾静脉注射干细胞来源的外泌体制剂治疗肺损伤：将小鼠固定在专用的固定器中，左手无名指和中指加进小鼠尾部，食指和拇指夹紧尾部后面，水平拉直尾部；1ml注射器吸入外泌体（1μg/μl），排除空气，针面朝上水平插入血管；针进入血管后有落空感，进入后水平推针注射100μl外泌体。气管插管注射干细胞来源的外泌体制剂治疗肺损伤：小鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛（330mg/kg）麻醉小鼠；麻醉后的小鼠仰卧于小鼠固定台上，对四肢和头部牙齿进行固定。气管插管注射100μl外泌体（1μg/μl）用来治疗肺损伤。实施例5，本发明提供肺部结构以及功能恢复鉴定的方法。苏木素&伊红染色评价损伤组织结构恢复情况：使用干细胞来源的外泌体治疗放射性肺损伤，在处理后14d，28d进行取材；急性肺损伤组，在损伤后12h，24h对肺部组织进行取材，进行组织固定、脱水、透明、浸蜡后制作石蜡切片，切片厚度为5mm，然后进行苏木素伊红染色，对肺部损伤及修复情况进行评估，表明干细胞来源的外泌体可以减轻肺部损伤（图2a和图3a）。masson染色评价肺部组织纤维化情况：使用干细胞来源外泌体治疗放射肺损伤或者肺纤维化，在第8周时，处死小鼠对损伤组织取材，制作石蜡切片，并对其进行masson染色，对损伤组织纤维化水平进行评估，表明干细胞来源的外泌体可以减轻损伤组织纤维化，并促进损伤组织结构和功能的恢复（图2b）。肺部灌洗液检测肺部炎症反应：小鼠麻醉后进行固定，将小鼠喉咙处皮肤剪开，分离气管周围组织，暴露气管；针头吸入0.3mlpbs，然后插入气管，进行气管灌洗，反复冲洗三次后收集到1.5mlep管中。灌洗液4℃，1500r离心10min，收集上清进行总蛋白和炎症因子检测；pbs重悬细胞沉淀，通过细胞涂片瑞氏染色来检测炎症细胞的数量。结果表明干细胞来源的外泌体治疗肺损伤可以显著改善肺部总蛋白情况（图2c）肺部组织干湿比检测肺部水肿:使用干细胞来源的外泌体治疗放射性肺损伤，在处理后14d，28d进行取材；急性肺损伤组，在损伤后12h，24h对肺部组织进行取材；肺部组织用锡箔纸包裹，称重；肺部组织放入65℃烘箱中进行干燥，干燥24h后进行称重；计算肺部组织的湿重干重比值（图3d）。结果表明，干细胞来源的外泌体制剂治疗后可以显著改善肺部水肿情况。实时荧光定量pcr：评价干细胞来源的外泌体对肺部炎症因子基因表达情况改变；使用trizol法提取细胞内总rna，通过反转录获得cdna后，通过real-timepcr对炎症相关基因进行rna水平的检测。结果表明干细胞来源的外泌体，可以更好的抑制肺部炎症基因的表达（图4）。当前第1页12