一种含子宫内膜间充质干细胞外泌体的注射液的制作方法

本发明涉及生物干细胞技术领域，尤其涉及一种含子宫内膜间充质干细胞外泌体的注射液。

背景技术

卵巢早衰其定义为在青春期后、40岁前发生的非生理性闭经以及自然停经的类似症状，常伴有潮热、盗汗、原发或继发不育、全身和生殖器萎缩为特征的一种疾病,其病因主要包括遗传性因素、免疫性因素、医源性因素(包括化疗和放疗)及其他因素。

外泌体是由细胞分泌的直径为30～150nm的小囊泡，内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子，在细胞交流间起重要作用。

外泌体是细胞分泌的小生物膜囊泡，与间充质干细胞相比，外泌体体积更小、复杂性更低，易于生产和存储，质干细胞外泌体富含生物活性分子，如蛋白质和rna；存在于外泌体中的许多蛋白质都属于酶类，具有催化活性。

间充质干细胞外泌体没有细胞的活性，并且不存在形成肿瘤的风险；此外，由于膜结合蛋白含量较低，外泌体的免疫原性低于间充质干细胞；间充质干细胞外泌体对维持细胞内稳态以及对外界刺激作出反应起到了重要的作用；当组织微环境稳态因疾病或损伤而遭到破坏时，这种作用就显得更加重要了。

因此如何使得子宫内膜来源的间充质干细胞外泌体修复卵巢结构，使卵巢的内分泌功能得到恢复成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种含子宫内膜间充质干细胞外泌体的注射液，该注射液利用干细胞分泌的外泌体为治疗卵巢早衰等疾病提供了安全、有效、使用方便的治疗药物。

如图所示，本发明是通过以下技术方案予以实现：一种含子宫内膜间充质干细胞外泌体的注射液，按体积份数比，包括5份间充质干细胞外泌体以及95份基质溶液，按体积份数比，基质溶液包括90-95份复方电解质注射液、3-5份雌激素以及1-5份药用人血白蛋白，间充质干细胞外泌体通过自体子宫内膜间充质干细胞饥饿培养所得，饥饿培养的时间为12-24小时，自体子宫内膜间充质干细胞提取自人子宫内膜的间充质干细胞，按照正常培养的方法进行培养得到，培养时间为48-72小时。

根据上述技术方案，优选地，复方电解质注射液为复方电解质葡萄糖mg3注射液。

根据上述技术方案，优选地，基质溶液的ph值为6.0-8.0。

根据上述技术方案，优选地，其主要用于治疗卵巢早衰。

一种含子宫内膜间充质干细胞外泌体的注射液的制备方法，包括以下步骤：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从子宫内膜中分离出间充质干细胞，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12-24小时，待细胞生长程度达到90％-95％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比2-4％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按体积分数比，取用3-5份雌激素以及1-5份药用人血白蛋白溶解于90-95份复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备注射液：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

本发明的有益效果是：将间充质干细胞外泌体混合到基质溶液中，使得外泌体的活性及功能得到了保存和利用，而且存活的时间可以更长，能够修复卵巢结构，使卵巢的内分泌功能得到了恢复，同时生育能力得到了很大的改善。

附图说明

图1示出了根据本发明的实施例的培养的子宫内膜间充质干细胞图。

图2示出了根据本发明的实施例的不同实验组血清中fsh(miu/ml)水平。

图3示出了根据本发明的实施例的不同实验组初级卵泡计数。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供了一种含子宫内膜间充质干细胞外泌体的注射液，按体积份数比，包括5份间充质干细胞外泌体以及95份基质溶液，按体积份数比，基质溶液包括90-95份复方电解质注射液、3-5份雌激素以及1-5份药用人血白蛋白，间充质干细胞外泌体通过自体子宫内膜间充质干细胞饥饿培养所得，饥饿培养的时间为12-24小时，自体子宫内膜间充质干细胞提取自人子宫内膜的间充质干细胞，按照正常培养的方法进行培养得到，培养时间为48-72小时。

根据上述实施例，优选地，复方电解质注射液为复方电解质葡萄糖mg3注射液。

根据上述实施例，优选地，基质溶液的ph值为6.0-8.0。

根据上述实施例，优选地，其主要用于治疗卵巢早衰。

一种含子宫内膜间充质干细胞外泌体的注射液的制备方法，包括以下步骤：

实施例1：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从子宫内膜中分离出间充质干细胞，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12小时，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比2％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按体积分数比，取用3-5份雌激素以及1-5份药用人血白蛋白溶解于90-95份复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备注射液：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

实施例2：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从子宫内膜中分离出间充质干细胞，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养16小时，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比3％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按体积分数比，取用3-5份雌激素以及1-5份药用人血白蛋白溶解于90-95份复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备注射液：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

实施例3：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从子宫内膜中分离出间充质干细胞，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养24小时，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比4％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按体积分数比，取用3-5份雌激素以及1-5份药用人血白蛋白溶解于90-95份复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备注射液：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

实施例4

如图所示，试验采取以下步骤：

(1)选取7周龄的sd大鼠将大鼠随机分为a、b、c、d、e共5组，每组25只；

(2)腹腔注射环磷酰胺造模结束后立即移植干细胞，移植后d1、d15，d30，d45处死前大鼠前取眶静脉血3-5ml，静置30min，以3000r/min离心10min，取血清约1ml，保存于-80℃冰箱内，用于fsh的检测；计数各级卵泡数目：造模前、移植后d1、d15，d30，d45四个时相点取四组大鼠的左侧卵巢标本，10％中性福尔马林固定24h，石蜡包埋，连续切片进行he染色，切片厚度5μm/张，每隔九张即取第十张切片，常规he染色后400倍光镜下计数切片内的初级卵泡总数目。

本发明的有益效果是：将间充质干细胞外泌体混合到基质溶液中，使得外泌体的活性及功能得到了保存和利用，而且存活的时间更长，能够修复卵巢结构，使卵巢的内分泌功能得到了恢复，同时生育能力得到了很大的改善。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。