基质金属蛋白酶抑制性多肽金纳米颗粒组合物及其应用、制备方法与流程

本发明属于药物制剂领域，涉及一种能够抑制基质金属蛋白酶-2/9的多肽纳米粒组合物及其制备方法。

背景技术：

随着生物医药技术的发展，越来越多的多肽蛋白药物得到研究开发并应用于临床，同时也给药物制剂带来新挑战。由于多肽和蛋白药物的不稳定和易变质，将其制成稳定、安全和高效的药物制剂是一项复杂艰巨的工作。目前对于多肽蛋白药物的给药系统进行了大量的研究，已有用于不同的给药途径的多种新型给药系统见于报道。

一、肿瘤转移

据世界卫生组织(who)报道，肿瘤是发病和死亡的主要原因，2015年导致880万人死亡，预计今后20年新发病例数将增加约70％，从全球情况看，近1/6的死亡由肿瘤造成。研究发现，肿瘤转移是90％的肿瘤病人死亡的原因，是肿瘤临床治疗中的世界性难题。肿瘤侵袭转移是恶性肿瘤的重要生物学特征.大多数肿瘤患者并非死于原发性肿瘤而是死于转移性肿瘤。肿瘤的转移是一系列因素、基因相互关联作用的多步骤的多阶段过程，其基本过程为：1)脉管新生：原发灶肿瘤细胞大量增殖，新生血管生长；2)细胞外基质降解：肿瘤细胞通过分泌各种酶类降解细胞外基质，消除了肿瘤周围的屏障，其中最重要的酶类是基质金属蛋白酶；3)原发肿瘤细胞脱落：肿瘤细胞从原发灶脱落；4)肿瘤细胞内渗血管或淋巴管：脱落的肿瘤细胞，侵袭基底膜，进而内渗到血管或淋巴管；5)循环、生存：少数肿瘤细胞能够在循环系统中存活，随血流、淋巴流迁移到另一远隔部位或器官；6)侵袭转移的肿瘤细胞通过与靶器官的内皮和基底膜发生黏附，形成微小转移灶，细胞增殖并产生新的血管，进而形成继发性转移瘤，肿瘤细胞可以再侵袭和转移。

细胞外基质在肿瘤细胞侵袭转移中起关键作用，肿瘤细胞与其生存的宿主组织基质外环境的平衡性是肿瘤转移的关键因素。在参与肿瘤细胞的侵袭转移调控过程中，蛋白水解酶(proteases)扮演了重要的角色，尤其是细胞外的蛋白质水解酶，因为它们直接参与了肿瘤细胞与周围基质细胞和基质成份之间的酶解作用，改变了它们固有的平衡状态，导致了肿瘤细胞的恶化，例如金属蛋白酶、尿激酶、furin蛋白酶等。其中，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，mmps)是降解细胞外基质的重要酶类，在多种肿瘤中均存在高表达，且与肿瘤的侵袭和转移密切相关，通过多种机制影响肿瘤的增殖、迁移和侵袭[5]，在肿瘤治疗方面是一大研究热点。鉴于此，寻找和研发有效的具有抗肿瘤转移作用的药物将是降低肿瘤病死率的重要策略。

肿瘤转移是一个多步骤的复杂过程，基质金属蛋白酶在此过程中发挥着非常重要的作用，是肿瘤侵袭转移过程中最重要的调控分子之一。若能以此为靶点，研制出可抑制肿瘤转移的基质金属蛋白酶抑制剂(mmpinhibitors，mmpis)，将具有巨大的社会意义和经济价值。

二、基质金属蛋白酶

1基质金属蛋白酶

mmps是一类锌离子和钙离子依赖的蛋白水解酶，可以催化细胞外基质的水解。mmps和组织金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinases，timps)一起调控细胞外基质的降解，调控机制的不平衡会使细胞外基质过度降解，导致一系列疾病如肺气肿、多发性硬化症、关节炎、牙周炎和肿瘤的侵袭转移等。传统抗肿瘤药物的研究，强调利用药物直接杀死肿瘤细胞，而肿瘤的转移才是导致肿瘤患者死亡的主要原因。细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤侵袭和转移的关键环节，mmps是目前已知能降解细胞外基质的重要酶类。因此，mmps是肿瘤治疗的新靶点，开发能抑制mmps生成和活性的药物有助于抑制肿瘤的进程，提高肿瘤治疗效果。

mmps是一类可以降解细胞外基质的酶，需要锌离子和钙离子活化之后才能发挥其活性。1962年gross首次在蝌蚪尾巴退化过程发现这种酶，人类现已发现20多种mmps。基于mmps的底物特异性和结构特点，mmps可分为6类：胶原酶类、明胶酶类、基质降解酶类、间质溶解素类、膜型基质金属蛋白酶(membranetypemmp，mt-mmp)和其他mmps。信号肽区、前肽区、催化活性区、铰链区域和羧基末端区共同组成了mmps的基本结构。信号肽位于蛋白酶的氨基末端，新生成的肽通过信号肽序列的引导进入胞浆；前肽结构域含有半胱氨酸开关，该半胱氨酸可以和锌结合，从而使mmps酶原不能被活化；催化结构域在其活性中心有3个组氨酸与锌离子结合；一个富含脯氨酸的铰链区域将催化活性区和羧基末端区连接在一起，羧基末端区识别特异性的底物或配体，以及与内源性抑制剂的结合，有助于对亚细胞定位和诱导各种mmps的活化或抑制。除了这5种基本结构外，哺乳动物的mmps的结构不断发生演变，有的mmps还有其他特殊结构。

2基质金属蛋白酶2/9

基质金属蛋白酶mmps能降解几乎全部的细胞外基质，是与肿瘤转移最密切相关的蛋白酶，其中mmp-2又称为明胶酶-a，mmp-9又称为明胶酶-b，mmp-2和mmp-9的催化域中含有胶原结合区域，能特异性的降解基底膜(bm)和细胞外基质(ecm)的主要成分ⅳ型胶原，因此它们被认为是肿瘤侵袭与转移中最重要的基质金属蛋白酶。mmp-2和mmp-9一经合成即以无活性形式从细胞内分泌到细胞外,被特殊的蛋白酶切割而产生活性。其中，mmp-2无活性形式时，分子量大小为72kd，活化后的分子量大小为66kd；mmp-9无活性和有活性时的分子量大小分别为92kd和83kd。有研究报道，二者除了能特异性的降解细胞外基质的主要成分ⅳ型胶原外，还具有上调相关血管新生因子的表达，从而参与肿瘤组织的血管新生，进一步促进了肿瘤的转移。

3基质金属蛋白酶抑制剂

自20世纪90年代以来，mmpis的发展尤为迅速。至今为止，科学家们设计并合成了大量的mmpis，其中部分已进入临床试验。根据来源可将mmpis分为3类：1)内源性抑制剂，即体内存在的mmps抑制因子，如人体中的timps；2)人工合成或表达的抑制剂，包括基于肽的mmps抑制剂、双磷酸盐类以及单抗等；3)从天然产物中分离得到的抑制剂，如四环素类及其衍生物、苔藓抑素类、新伐司他(neovastat)及一些黄酮类化合物等。

mmpis的设计与合成已有近20年历史。到目前为止，也已经有多个mmpis作为临床候选药物进行抗肿瘤研究，但是由于缺乏选择性，部分mmpis的临床疗效不佳。早期的mmpis大部分通过自身结构中的锌离子螯合基团与mmp的锌离子螯合而发挥抑制mmp的作用，而锌离子螯合基团这一结构本身就是mmpis选择性较差的原因。这些mmpis在抑制肿瘤部位的mmps的同时，也抑制了其他发挥生理作用的mmps。除此之外，不同类型肿瘤，以及同一肿瘤在不同的发展阶段，发挥作用的mmp各不相同，因此，鉴别肿瘤中的mmp家族成员对于精准治疗的实施非常关键。近年来，随着对mmpis研究的深入，人们发现了越来越多的非锌离子螯合剂类mmpis，还有能特异性抑制某种mmp的mmpis，以此为基础进行修饰改造，有望获得高选择性的mmpis。可以相信，随着对mmps认识和研究的不断深入，高选择性抗肿瘤mmpis设计开发的成功率会大大提高。

三、基质金属蛋白酶抑制剂

鉴于mmps在生理和病理进程中起着关键性的作用，对于基质金属蛋白酶抑制剂的研究开发是十分必要的。从上个世纪1990s以来，mmpis的发展尤为迅速。到目前为止，科学家们设计并合成了大量的mmpis，部分已进入临床试验。根据mmpis的来源将抑制剂分为三类：⑴内源性抑制剂，即体内存在的mmp抑制因子，如人体中的timp；⑵人工合成或表达的抑制剂，包括基于肽的mmp抑制剂、双磷酸盐类以及单抗等；⑶从天然产物中分离得到的抑制剂，如四环素类及其衍生物、苔藓抑素类、neovastat及一些黄酮类化合物等。

本课题组近些年来针对mmp与肿瘤侵袭转移的关系进行了一系列研究，设计并合成了系列基质金属蛋白酶抑制性多肽。

由于多肽具有生物相容性好、易被人体吸收等优点，越来越多的科学家进行了多肽药物的开发，但是由于人体吸收的首过效应、多肽生理条件下稳定性差等原因，多肽一般不用于口服给药，通常采用多次注射方式给药，在实际的临床应用过程中，给患者带来不便。近些年来，随着纳米技术的发展，纳米技术与生物技术的融合，使纳米生物技术获得了很多重要的进展，作为载体，纳米粒可以用于口服、注射、肺吸入等多种途径。对于口服或肺吸入的多肽药物而言，改善纳米粒的粘膜粘附性质显然有助于改进有效性和延长作用时间。

在众多的纳米材料中，金纳米粒子aunp具有生物安全，理化均一，表面易修饰等优点，因而被广泛应用于纳米药物系统的研究。纳米金作为纳米粒子中应用较为成熟的纳米载体，可定向输送和释放靶向性药物。通过将多肽修饰到纳米金表面，从而构建多肽纳米药物，能够增强多肽的稳定性、促进多肽药物的吸收、对纳米药物进行进一步修饰，还可以增加其靶向性。研究表明，生物分子和纳米金相连的纳米粒子，其生物相容性好，是实现细胞外物质的跨膜传输的一种优良载体。借助纳米生物技术的飞速发展，纳米药物以及纳米输运系统在基础研究和临床医学领域已经得到了初步应用，其中抗肿瘤药aurimunetm(cyt-6091)已经完成ⅰ期临床试验，正在进行ⅱ期临床试验。纳米金的药用研究的发展迅速，显示出良好的应用前景。

基于以上研究，本发明设计制备了基质金属蛋白酶纳米抑制性多肽，通过au-s键，将多肽修饰到纳米金表面，得到一种新型的多肽金纳米颗粒组合物。有文献报道，将多肽与金纳米颗粒相连，能够使多肽在体内半衰期显著延长、不易被体内蛋白酶水解，稳定性增高，从而最大程度发挥其活性，有望开发成对肿瘤侵袭转移抑制效果更强的药物。

技术实现要素：

本发明的目的是制备一种能够抑制基质金属蛋白酶-2/9的多肽纳米粒组合物。将能够抑制基质金属蛋白酶-2/9的多肽药物连接在生物相容性良好的金纳米颗粒上，制备成纳米粒。本发明制备的纳米粒稳定性高，药物活性好。

一种基质金属蛋白酶抑制性多肽金纳米颗粒组合物，其特征在于所述的组合物为基质金属蛋白酶-2/9抑制性多肽与金纳米颗粒连接形成；其中所述的组合物由如下步骤制备而成：

第一步：氯金酸溶液和多肽溶液混合，搅拌均匀；

第二步：在上述混合溶液中加入硼氢化钠溶液，在冰水浴下避光搅拌；

第三步：将第二步的反应产物溶液经透析去除未参与反应的多肽和其他副产物，得到多肽纳米粒组合物溶液，再经冷冻干燥得到组合物。

所述的组合物，其特征在于，所述的多肽是基质金属蛋白酶-2/9抑制性多肽，包括下列多肽的任意一种多肽或两种以上多肽的混合：

proargtrpphexaa(d-arg)glygluglyglyglyglyglucysgly，

proargtyrhisgly(d-his)xaa(d-arg)glygluglyglyglyglyglucysgly，

proarghisgly(d-his)xaa(d-arg)glygluglyglyglyglyglucysgly，

其中xaa＝d-bip，d-bip为d型的二苯基丙氨酸。

所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中的金纳米颗粒的粒径为1—1000nm。

所述的组合物在制备抑制抗肿瘤药物中的应用。

多肽纳米粒组合物，能够抑制肿瘤的迁移、侵袭，且具有抗肿瘤增殖活性。

所述的多肽纳米粒组合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

第一步：氯金酸溶液和多肽溶液混合，搅拌均匀。

第二步：在上述混合溶液中加入硼氢化钠溶液，在冰水浴下避光搅拌。

第三步：将第二步的反应产物溶液经透析去除未参与反应的多肽和其他副产物，得到多肽纳米粒组合物溶液，再经冷冻干燥得到多肽纳米粒组合物。

有益效果：

本发明采用的序列的是全新序列，本发明首次采用多肽纳米粒组合物形式进行药效分析，结果显示多肽纳米粒组合物与多肽或纳米金相比，对肿瘤细胞的迁移和侵袭有更高的抑制活性。

附图说明

图1为多肽纳米粒组合物的电镜图

图2多肽纳米粒组合物的对mmp2/9酶活力的抑制作用(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vscontrol)

图3不同浓度的多肽纳米粒组合物aunp-pg16对人胃癌细胞mgc803细胞迁移图片

图4不同浓度的多肽纳米粒组合物aunp-pg16对人胃癌细胞mgc803细胞迁移抑制率

图5不同浓度的多肽纳米粒组合物aunp-pg16对人胃癌细胞mgc803细胞侵袭抑制率

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1

多肽纳米粒组合物的制备

将多肽(proargtrpphexaa(d-arg)glygluglyglyglyglyglucysgly，其中xaa＝d-bip，d-bip为d型的二苯基丙氨酸)，溶于去离子水中，将多肽溶液(1mg/ml，4ml)与氯金酸(haucl4，0.2428m，l0μl)溶液混合，在冰水浴下避光搅拌10min；加入硼氢化钠(nabh4，0.20m，125μl)，继续搅拌4h，得到多肽纳米粒组合物溶液，经透析和冷冻干燥后，4℃冷藏保存。多肽纳米粒组合物的形貌如图1所示。

荧光检测法检测多肽纳米粒组合物对mmp酶的抑制活性

(1)mmp-2/9酶的加入：在全黑的96孔板中加入10μl稀释好的重组人基质金属蛋白酶mmp-2(或mmp-9酶)；

(2)待测样品的加入：再加入事先配制的不同浓度的不同待测样品，并设置相应的空白对照组。

(3)荧光底物es001的加入：每孔加入10μl稀释好的荧光底物es001，加入之后，用移液枪反复吹吸，快速混匀。

(4)荧光信号的检测：在328nm激发波长，392nm发射波长下，用多功能酶标仪检测荧光信号的变化情况。

(5)具体结果如图2所示，多肽纳米粒组合物对重组人基质金属蛋白酶-9(mmp-9)的活性有较强的抑制能力。

实施例2

多肽纳米粒组合物的制备

将多肽(proargtyrhisgly(d-his)xaa(d-arg)glygluglyglyglyglyglucysgly，其中xaa＝d-bip，d-bip为d型的二苯基丙氨酸)溶于去离子水中，将多肽溶液(1mg/ml，3ml)与氯金酸(haucl4，0.2428m，l0μl)溶液混合，在冰水浴下避光搅拌10min；加入硼氢化钠(nabh4，0.20m，125μl)，继续搅拌4h，得到多肽纳米粒组合物溶液，经透析和冷冻干燥后，4℃冷藏保存。

多肽纳米粒组合物对肿瘤细胞细胞迁移影响的研究

(1)药物的配制：药物均用无血清的dmem培养基配制，采用等倍稀释法进行梯度稀释；空白对照组：不含药物的无血清dmem；阳性对照组：0.20μm的avastin注射液；每个剂量设置两个复孔。

(2)细胞的消化：将培养到对数生长期的肿瘤细胞，用胰蛋白酶进行消化、离心、无血清的dmem培养基重悬、用细胞计数仪进行计数，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml；将细胞接种于小室内，100μl/小室；

(3)加药：将提前配制好的不同组别的药物加入到对应的小室中，100μl/小室；

(4)在24孔板中，每孔加入600μl含10％fbs的dmem完全培养基，将24孔板放置于5％co2、37℃培养箱中培养24h；

(5)24h后，弃去transwell小室和24孔板中的培养液；transwell小室用pbs润洗2次；将小室放于盛有600μl预冷的无水乙醇的24孔板中，常温固定30min；0.2％结晶紫常温染色10min，清水漂净；用棉签轻轻擦掉小室膜上层未迁移细胞，显微镜下观察并随机选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migrationinhibitionrate，mir)：

其中ntest为给药组细胞迁移数，ncontrol为空白对照组细胞迁移数。

(6)实验结果

具体结果如图3、4所示，多肽纳米粒组合物对肿瘤细胞的迁移能力有较强的抑制活性，与阳性对照(avastin)活性相近。

实施例3

多肽纳米粒组合物的制备

将多肽(proarghisgly(d-his)xaa(d-arg)glygluglyglyglyglyglucysgly，其中xaa＝d-bip，d-bip为d型的二苯基丙氨酸)溶于去离子水中，将多肽溶液(1mg/ml，3ml)与氯金酸(haucl4，0.2428m，l0μl)溶液混合，在冰水浴下避光搅拌10min；加入硼氢化钠(nabh4，0.20m，125μl)，继续搅拌4h，得到多肽纳米粒组合物溶液，经透析和冷冻干燥后，4℃冷藏保存。

多肽纳米粒组合物对肿瘤细胞侵袭影响的研究

(1)小室铺胶：实验前一天，将10mg/mlmatrigel用无血清的dmem培养基于ep管中按1:3稀释，并用枪头反复吹打混匀，放于冰盒上，以防凝固。取出干净无菌的transwell小室，吸取稀释过的matrigel均匀涂布于transwell小室膜上，20μl/小室；铺胶完成后将小室置于超净台中室温小风风干2h，风干后，盖上盖子放于37℃培养箱中过夜，第二天使用前，在超净台中紫外照射半小时后使用；

(2)其余步骤同细胞迁移。

(3)实验结果

具体结果如图5所示，多肽纳米粒组合物对肿瘤细胞的侵袭能力有较强的抑制活性，与阳性对照(avastin)活性相近。

序列表

<110>中国药科大学

<120>基质金属蛋白酶抑制性多肽金纳米颗粒组合物及其应用、制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

proargtrpphexaaargglygluglyglyglyglyglucysgly

151015

<210>2

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

proargthrhisglyhisxaaargglygluglyglyglyglyglucys

151015

gly

<210>3

<211>16

<212>prt

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>3

proarghisglyhisxaaargglygluglyglyglyglyglucysgly

151015