本发明涉及红葱提取技术领域，特别涉及一种红葱总蒽醌的制备方法及其应用。
背景技术：
红葱(eleutherineamericanamerr.etk.heyne)，多年生草本，为鸢尾科(iridacea)红葱属eleutherine植物，主要分布于广东、海南、广西南部、云南南部、台湾及福建等地；非中国药典收载用药，但为南方少数民族如傣族、彝族、德昂族、黎族等常用中草药。药用部位为全草、鳞茎，该药性苦，味凉，具有清热解毒、散瘀消肿、止血之功效，民间常用于治疗心悸、头晕、跌打肿痛、吐血、咯血等症。药理活性筛选表明红葱提取物具有多方面的药理活性，包括：抗细菌、抗真菌、扩张动脉血管、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等。化学成分研究方面，已有学者从红葱中分离得到不同结构类型的化合物，如萘酚类、萘醌类、糖苷类、甾体类等，其中萘酚和醌类含量最为丰富。红葱总蒽醌是红葱的主要成分之一，经研究发现其可用作制备抗菌或舒张血管的有效药物，同时对于进一步综合利用药材，带动山区经济的发展具有很重要的现实意义。但现有关于红葱总蒽醌的提取方法及其在抗菌和舒张血管方面的治疗药物中的运用研究报道较少，因此，目前亟需研究提取纯度高、提取效果稳定、操作简便且安全的红葱总蒽醌的提取方法，以提高红葱总蒽醌在抗菌和舒张血管方面的治疗药物中更广泛运用。
技术实现要素：
鉴于此，本发明提出一种操作简单、提取纯度高、提取效果稳定且安全无污染的红葱总蒽醌的制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种红葱总蒽醌的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取红葱干燥的上部分或鳞茎，净选、粉碎，加入至90～95％乙醇中浸泡、提取、过滤；过滤后的药渣，再加入90～95％乙醇提取2-3次，过滤，合并滤液，并将滤液减压浓缩得到浓缩液，冷却；
(2)富集：
上柱液的处理：按浓缩液与水的体积比为(0.5-3)：1，向浓缩液中加入中性水，加热至30-50℃，搅拌溶解，得到处理液；
树脂吸附：将处理液继续加热至60-75℃，用大孔吸附树脂吸附，然后用水或质量浓度为1-15％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为50-95％的乙醇洗脱至洗脱液不含总蒽醌成分；
(3)精制：
将步骤(2)得到的50-95％的乙醇洗脱液，经减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至色谱柱，用25～30％和45～50％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％甲醇溶液洗脱四个柱体积，再用纯丙酮洗脱四个柱体积，收集甲醇和丙酮洗脱液，浓缩至干或喷雾干燥，研细，粉碎，过筛，包装，即得红葱总蒽醌。
本发明公开一种红葱总蒽醌的制备方法，通过采用红葱干燥的上部分或鳞茎，并设计其提取、富集和精制的工艺步骤和参数，获得红葱总蒽醌的最佳制备工艺，有效得到具有显著药理活性的红葱总蒽醌，从而实现有效利用和开发红葱药用植物资源，将红葱总蒽醌作为有效成份，运用于抗菌和舒张血管的治疗药物中，以期为临床提供一种副作用小、不良反应发生率低，且疗效确切，可长期服用的抗菌和舒张血管的现代黎药制剂。该治疗药物的剂型可以为胶囊(软胶囊)、颗粒剂(干混悬剂)、片剂(分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片)、溶液剂(糖浆)、丸剂(浓缩丸、滴丸、微丸)或注射剂型。
进一步说明，步骤(1)中，所述滤液减压浓缩至55～65℃，得到热测相对密度为1.20-1.30的浓缩液。控制滤液减压浓缩的稳定和相对密度，使浓缩液中红葱总蒽醌的含量更加稳定。
进一步说明，步骤(2)中，向浓缩液中按浓缩液与水的体积比为2：1加入中性水。
进一步说明，步骤(2)中，向浓缩液中加入中性水后，加热至38～45℃搅拌溶解，得到处理液。
进一步说明，步骤(2)中，将处理液继续加热至65-70℃后，保持恒温3～5min。通过控制浓缩液与中性水的溶解稳定，提高红葱有效成分溶解的稳定性，同时将处理液进一步加热至65-70℃，并恒温保持3～5min,使红葱总蒽醌的提取纯度高且稳定，提取效果更好。
进一步说明，步骤(2)中还包括超声波处理，将处理液继续加热后，采用超声波进行2～3次超声波处理，每次处理5min，间隔2min，超声波功率为30w，超声波频率为20khz。通过进一步的超声波处理，使红葱总蒽醌提取效果的稳定性更好。
进一步说明，所述大孔吸附树脂为d101型大孔吸附树脂、ab-8型大孔吸附树脂、d201型大孔吸附树脂中的一种或多种。
进一步说明，步骤(1)中，浸泡时间为24～36h，浓缩液冷却至23～27℃。
进一步说明，步骤(3)中，所述色谱柱为50～70um的mci色谱柱，上样至色谱柱后，用30％和50％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色。
本发明提供一种红葱总蒽醌在抗菌和舒张血管的治疗药物、辅助治疗抗菌和舒张血管的保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的红葱总蒽醌的制备方法，具有操作简单、提取纯度高、提取效果稳定、安全无污染的特点。其中，在富集过程中，将浓缩液与中性水在一定温度下按体积比为(0.5-3)：1进行溶解，得到稳定好且高溶解度的处理液，同时对该处理液进行了加热处理，使处理液中的红葱总蒽醌成分与其他化合物得到最大程度的分离效果的基础上，再采用大孔吸附树脂和乙醇进行吸附洗脱，大大提高了红葱总蒽醌提取效果的稳定性，最后依次选用不同浓度的甲醇水溶液、纯甲醇溶液和纯丙酮进行重复洗脱，提高红葱总蒽醌的提取纯度，而且避免有毒有害溶剂，操作简单、安全无污染。将红葱总蒽醌作为有效成份，运用于抗菌和舒张血管的治疗药物中，具有副作用小、不良反应发生率低，且疗效确切，可长期服用的特点。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-一种红葱总蒽醌的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取红葱干燥的上部分，净选、粉碎，加入至90％乙醇中浸泡24h、提取、过滤；过滤后的药渣，再加入90％乙醇提取2次，过滤，合并滤液，并将滤液减压浓缩得到浓缩液，冷至23℃；
(2)富集：
上柱液的处理：按浓缩液与水的体积比为0.5：1，向浓缩液中加入中性水，加热至30℃，搅拌溶解，得到处理液；
树脂吸附：将处理液继续加热至60℃，用d101型大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为95％的乙醇洗脱至洗脱液不含总蒽醌成分；
(3)精制：
将步骤(2)得到的95％的乙醇洗脱液，经减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至mci(50um)色谱柱，用25％和45％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％甲醇溶液洗脱四个柱体积，再用纯丙酮洗脱四个柱体积，收集甲醇和丙酮洗脱液，浓缩至干，研细，粉碎，过筛，包装，即得红葱总蒽醌。
实施例2-一种红葱总蒽醌的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取红葱的鳞茎，净选、粉碎，加入至95％乙醇中浸泡36h、提取、过滤；过滤后的药渣，再加入95％乙醇提取3次，过滤，合并滤液，并将滤液减压浓缩至55℃，得到热测相对密度为1.20的浓缩液，冷至27℃；
(2)富集：
上柱液的处理：按浓缩液与水的体积比为3：1，向浓缩液中加入中性水，加热至50℃，搅拌溶解，得到处理液；
树脂吸附：将处理液继续加热至75℃，用ab-8型大孔吸附树脂吸附，然后用质量浓度为15％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为50％的乙醇洗脱至洗脱液不含总蒽醌成分；
(3)精制：
将步骤(2)得到的50％的乙醇洗脱液，经减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至mci(70um)色谱柱，用30％和50％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％甲醇溶液洗脱四个柱体积，再用纯丙酮洗脱四个柱体积，收集甲醇和丙酮洗脱液，喷雾干燥，研细，粉碎，过筛，包装，即得红葱总蒽醌。
实施例3-一种红葱总蒽醌的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取红葱干燥的上部分，净选、粉碎，加入至95％乙醇中浸泡24h、提取、过滤；过滤后的药渣，再加入95％乙醇提取3次，过滤，合并滤液，并将滤液减压浓缩至65℃，得到热测相对密度为1.30的浓缩液，冷至23℃；
(2)富集：
上柱液的处理：按浓缩液与水的体积比为2：1，向浓缩液中加入中性水，加热至45℃，搅拌溶解，得到处理液；
树脂吸附：将处理液继续加热至70℃，保持恒温3min，采用超声波进行2次超声波处理，每次处理5min，间隔2min，超声波功率为30w，超声波频率为20khz，用d201型大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为75％的乙醇洗脱至洗脱液不含总蒽醌成分；
(3)精制：
将步骤(2)得到的75％的乙醇洗脱液，经减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至mci(60um)色谱柱，用30％和50％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％甲醇溶液洗脱四个柱体积，再用纯丙酮洗脱四个柱体积，收集甲醇和丙酮洗脱液，浓缩至干，研细，粉碎，过筛，包装，即得红葱总蒽醌。
实施例4-一种红葱总蒽醌的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取红葱的鳞茎，净选、粉碎，加入至95％乙醇中浸泡36h、提取、过滤；过滤后的药渣，再加入95％乙醇提取3次，过滤，合并滤液，并将滤液减压浓缩至65℃，得到热测相对密度为1.30的浓缩液，冷至27℃；
(2)富集：
上柱液的处理：按浓缩液与水的体积比为2：1，向浓缩液中加入中性水，加热至38℃，搅拌溶解，得到处理液；
树脂吸附：将处理液继续加热至65℃，保持恒温5min，采用超声波进行3次超声波处理，每次处理5min，间隔2min，超声波功率为30w，超声波频率为20khz，用d201型大孔吸附树脂吸附，然后用质量浓度为8％的乙醇洗脱至洗脱液无色，再用质量浓度为75％的乙醇洗脱至洗脱液不含总蒽醌成分；
(3)精制：
将步骤(2)得到的75％的乙醇洗脱液，经减压回收乙醇，剩余提取液经浓缩后，上样至mci(60um)色谱柱，用30％和50％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色，继续用100％甲醇溶液洗脱四个柱体积，再用纯丙酮洗脱四个柱体积，收集甲醇和丙酮洗脱液，喷雾干燥，研细，粉碎，过筛，包装，即得红葱总蒽醌。
对比例1-依据实施例4的红葱总蒽醌的制备方法，仅改变步骤(1)中的滤液减压浓缩至50℃，得到热侧相对密度为1.10的浓缩液，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得红葱总蒽醌。
对比例2-依据实施例4的红葱总蒽醌的制备方法，仅改变步骤(2)中，按浓缩液与水的体积比为0.4：1，向浓缩液中加入中性水；其余的制备步骤和参数条件均相同，获得红葱总蒽醌。
对比例3-依据实施例4的红葱总蒽醌的制备方法，仅改变步骤(2)中，在常温下向浓缩液中加入中性水，搅拌溶解，得到处理液；其余的制备步骤和参数条件均相同，获得红葱总蒽醌。
对比例4-依据实施例4的红葱总蒽醌的制备方法，仅改变步骤(2)中，将搅拌溶解得到的处理液直接用大孔树脂吸附，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得红葱总蒽醌。
对比例5-依据实施例4的红葱总蒽醌的制备方法，仅改变步骤(2)中，将搅拌溶解得到的处理液继续加热至55℃，保持恒温3min；其余的制备步骤和参数条件均相同，获得红葱总蒽醌。
对比例6-依据实施例4的红葱总蒽醌的制备方法，仅改变步骤(3)中，将剩余提取液经浓缩后，上样至mci(60um)色谱柱，用30％和50％甲醇水溶液洗脱至洗脱液无色，100％甲醇溶液洗脱，收集甲醇洗脱液，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得红葱总蒽醌。
对比例7-依据实施例4的红葱总蒽醌的制备方法，仅改变步骤(2)中将处理液继续加热后，进行超声波处理10min，其余的制备步骤和参数条件均相同，获得红葱总蒽醌。
采用上述实施例1～4和对比例1～7的制备方法分别制备得到10组红葱总蒽醌样品，并且均测试其红葱总蒽醌样品的总蒽醌含量，并统计每组的红葱总蒽醌含量平均值，其结果如下表1：
由上表可以看出，由实施例1～4制备获得的总蒽醌含量均≥60％，平均率在，由此看出由本发明的制备方法制得的红葱总蒽醌的提取纯度高，且提取的效果稳定，且实施1～4的红葱总蒽醌的提取纯度明显高于对比例1～7，对比例1中降低了减压浓缩的温度和对比例2中改变了浓缩液与水的体积比，均影响了红葱总蒽醌的提取纯度；对比例3～对比例5中在常温下将浓缩液与中性水溶解混合、将处理液直接采用大孔树脂吸附或降低处理液的加热稳定，其红葱总蒽醌的提取纯度明显降低，且其提取的稳定性低；对比例6仅用甲醇进行洗脱，其红葱总蒽醌的提取纯度也明显降低；对比例7中改变了超声波处理的时间，也影响了红葱总蒽醌的提取纯度。
1、红葱总蒽醌体外抗菌试验
(1)平板的制备
指示菌平板分上下两层。首先加入8ml琼脂培养基作为下层培养基，完全凝固后轻轻放置4只牛津杯，然后加入20ml相应培养基作为上层培养基。待上层培养基完全凝固后，取出牛津杯。
挑取新鲜培养的指示菌株，将菌悬液浓度调至0.5mcfarland并均匀涂布在平板上，放置20～30min至平板表面无明显菌液，备用。
(2)抑菌实验和结果
将由实施例4制备获得红葱总蒽醌样品以无菌水或dmso稀释一定倍数后，离心取100μl加入指示菌平板的孔内，做为抑菌实验孔；向孔中加入100μl新鲜培养基做为阴性对照孔，阿莫西林溶液做为阳性对照。放入4℃冰箱扩散3h后，置于37℃或28℃培养24或48h，观测有无抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈直径，用抑菌圈外径d(cm)表示抑菌作用的强弱。
表1:红葱总蒽醌的抑菌试验
从以上杀菌试验结果表明：
高浓度的红葱总蒽醌对金黄色葡萄球、大肠杆菌和白色念株菌菌具有较强的抑制作用，其抑制效果甚至与阳性对照阿莫西林相当，低浓度的效果较弱，但也有一定的作用。
2.红葱总蒽醌血管舒张试验
(1)实验方法
颈椎脱臼法处死大鼠，迅速取出主动脉，置于通有混合气体的台氏液中，剪成每段3～4mm左右的血管环；取一段血管条，穿过固定的小棒，再用小钩将血管挂起，小钩用棉线连至传感器，最后将血管浸泡于装有台氏液、通有混合气体并保持37℃恒温的反应池中。通过软件，监控血管条的拉力状态，确保血管环的拉力平衡稳定。用kcl60mmol/l重复刺激3次，以诱发血管的最大收缩幅度，待血管收缩到最强并稳定时，将kcl洗净，依次加入样品和阳性药，记录平衡、收缩、舒张各个环节的血管张力。
(2)实验结果
将由实施例4制备获得红葱总蒽醌样品以无菌水或dmso稀释一定倍数，考察不同浓度总蒽醌(10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml)下对该模型的舒张作用，采用每个样品用5个血管环重复试验，记录平衡、收缩、舒张各个环节的血管张力。舒张率(％)＝(血管环预收缩最大张力－药物作用血管环张力)/(血管环预收缩最大张力－基础平衡张力)×100％。结果显示不同浓度下，化合物舒张血管作用分别达到了85.3％、61.8％、49.5％，高浓度与阳性药丹参酮ⅱa(86.3％)基本一致，表明红葱总蒽醌具有一定的舒张血管作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。