专利名称：L－β－二氧戊环尿苷类似物和治疗和预防病毒感染的方法
技术领域：
本发明涉及新的L-β-二氧戊环尿苷类似物和其在预防和治疗EB病毒(Epstein-Barr病毒)，水痘带状疱疹病毒(Varicella-Zoster病毒)和卡波西肉瘤病毒(Kaposi’s Sarcoma病毒)，也称为HV～8中的用途。
背景技术：
通过使用不断开发的抗生素药，人体细菌感染已经更容易控制和治疗，而病毒感染则仍然是更困难和更不易治疗的目标。寻找治疗病毒感染的药剂的重要性一直被放在首位。
EB病毒(EBV)是与单纯疱疹病毒(HSV)相关的重要的人类病原体，Elliot Kieff，病毒学，第3版，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley等编，EB病毒及其复制，第74章，p2343-2396和Alan B.Rickinson和ElliotKieff，出处同上，第75章，p2397-2446。EBV是Lumphocryptovirus属的淋巴营养成员，属于γ疱疹病毒科的亚家族。同属于此家族的另一种人病毒新成员是与卡波西肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV/HHV8)，Chang等，科学，2661865-1869(1994)；Cesarman等，新英格兰医学杂志，3321186-1191(1995)；Soulier等，血液，861276-1280(1995)。已鉴定出EBV的两种亚型，它们的基因组几乎相同，但尚不清楚EBV相关疾病和EBV亚型之间的关系。Abdul-Hamid等，病毒学，190168-175(1992)和Sample等，病毒学杂志，644084-4092(1990)。裂解性的EBV基因组是由60mol％鸟嘌呤和胞嘧啶组成的线性的，双链的，172Kbp的DNA。已测定基因组的序列，发现该序列能编码大量病毒特有的蛋白质，包括参与EBV裂解性感染过程中病毒DNA合成的几种酶。在体外，尽管EBV也可感染上皮细胞，但EBV感染一般局限于B-淋巴细胞，Sixbey等，自然，306480-483(1983)。在人类的B-淋巴细胞和T-淋巴细胞以及上皮细胞中可检测到病毒基因组。EBV基因组以线性形式裂解性复制，也可作为超卷曲的环形DNA潜伏起来。EBV基因组在被裂解性感染的细胞中的表达与在被潜伏感染的细胞中的表达非常不同。EBV特有的DNA聚合酶，DNA酶和dThd激酶仅通过裂解性DNA复制在细胞中表达。细胞培养研究揭示出EBV特有的DNA聚合酶对裂解性感染过程中EBV DNA复制的重要作用，但未揭示出该酶对超卷曲EBV DNA在被潜伏感染的细胞中的维持的作用。在被潜伏感染或转化的细胞中表达了特有的一套EBV蛋白质，包括EBVNA1，有时还包括EBNVLP，2，3A，3B，3C，LMP1，3B，3C，LMP以及LMP2，Elliot Kieff，病毒学，第3版，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley等编，EB病毒及其复制，第74章，p2343-2396和Alan B.Rickinson和Elliot Kieff，出处同上，第75章，p2397-2446。
EBV的结构类似于其它疱疹病毒，它具有包含在核衣壳中的双链DNA基因组，所述核衣壳被含有病毒糖蛋白的脂质包膜所包围，间层蛋白占据了包膜和核衣壳之间的空间。
尽管EBV对婴儿的初次感染几乎无症状，但经血清学证实的青少年或年轻人中的一部分(在有些研究中达50％)初次感染显示出传染性的单核细胞增多症(IM)，也称为“接吻病”。尽管有些EBV感染是通过输血传播的，但EBV主要通过唾液传播。大部分(＞85％)处于传染性单核细胞增多症急性期的病人分泌EBV。70年代中期，鉴定出EBV可在具有X-连锁免疫缺损的男孩中导致致命的IM/X-连锁的淋巴增殖性综合征(XLP)，Sullivan和Wood，免疫缺损评述，1325-347(1989)。还发现致命的EBV感染与未得到有效治疗的非家族性单一巨噬细胞综合征(VAHS)相关，Alan B.Rickinson和Elliot Kieff，病毒学，第3版，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley等编，EB病毒及其复制，第75章，p2397-2446和Craig等，美国临床病理学杂志，97189-194(1992)。
EB病毒也被看成是B细胞增殖性疾病的引发剂，它与多种疾病状态，包括罕见的进行性单核细胞增多症-样综合征和AIDS患者口毛粘膜白斑病相关。EBV也与某些类型的癌症相关，如Burkitt淋巴瘤，鼻咽癌，何杰金氏病，EBV-相关的T细胞淋巴瘤和鼻T细胞淋巴瘤。某些病人，特别是免疫系统受抑制的病人，如接受免疫抑制剂治疗的AIDS病人和器官移植病人对EBV表现，尤其是EBV相关淋巴瘤的发展特别易感。
Chu等人在PCT申请PCT/US95/01253中描述了许多用于治疗乙肝病毒和EB病毒感染的L-核苷类似物。在该PCT申请中公开的一种药剂，2’-氟-5-甲基-β-L-阿糖呋喃尿苷(L-FMAU)，显示出良好的抗EBV活性。值得注意的是，当L-FMAU的5-甲基被溴取得时，抗EBV活性降低。
几种化合物已经显示，在对细胞生长无毒的浓度，在培养时具有抗EBV复制活性。这些包括阿昔洛韦(ACV)，更昔洛韦(DHPG)，喷昔洛韦，D-FMAU和其类似物，5-溴乙烯基dUrd，膦酰基甲酸酯和硫代磷酸寡核苷。参见Lin等，Antimicrob.Agents and Chemo.(2月)32(2)265-267(1988)；Lin等，Antimicrob.Agents and Chemo.32(7)1068-1072(1988)；Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，802767-2770(1983)；Datta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775163-5166(1980)；Datta等，病毒学，11452-59(1981)；Lin等，Antimicrob.Agents and Chemo.311431-1433(1987)；Olka和Calendar，病毒学，104219-223(1980)；Lin等，病毒学杂志，5050-55(1984)；Yao等，Antimicrob.Agents and Chemo.371420-1425(1993)和Yao等，生化药物，(51)941-947(1966)。
发明目的本发明的目的是提供治疗和/或预防在患者体内的EB病毒，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)感染的化合物，药物组合物和方法。
发明简述本发明涉及这样一个发现，即某些含有尿嘧啶碱，优选地为5-卤素取代的尿嘧啶碱的β-L-二氧戊环尿苷类似物出乎意料地显示出具有很高的抗EB病毒，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)活性。具体地，本发明的化合物显示出很强的病毒复制(病毒生长)抑制作用，而对宿主细胞(即，动物或人体组织)只有很低的毒性。
本发明的化合物首先可以用作抑制EBV，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)生长或复制的药剂。这些药剂中的某些可以用于抑制其他病毒(例如，HSV)的生长或复制，或用于治疗其他病毒感染和/或相关病症。其他药剂可以用作试验目的的生物学探针，或在具有药理活性的相关核苷化合物的合成中用作中间体。
本发明化合物在抗折磨动物的病毒感染中发现了特别的用途，尤其是患有EB病毒，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)感染的人。本发明化合物作为目前几乎没有治疗方案的病症(EB病毒，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)感染)的治疗剂具有很大的潜力。本发明化合物可以单独使用，或与药剂或其他治疗结合。
本发明化合物是含有L-构型(与大多数天然存在的核苷的天然D-构型相反)和尿嘧啶碱的二氧戊环尿苷类似物。优选地，尿嘧啶碱在5-位被氟，氯，溴，碘，甲基或三氟甲基取代，而尿嘧啶碱在5-位的取代基以碘或溴是特别优选的。
本发明也涉及抑制EBV，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)生长或复制的方法，包括使病毒与抑制有效量或浓度的至少一种所公开的L-核苷类似物接触。此方法可以被用于比较试验，如测定相关的抗-EBV，抗-VSV或抗-HV-8化合物的活性，以及测定患者的EBV，VSV或HV-8感染对本发明化合物之一的敏感性的试验。本发明化合物优选地被用于治疗或预防人体的EBV，VSV或HV-8感染。
本发明的治疗方面涉及治疗或预防患者，优选人类患者的EBV，VSV或HV-8感染的方法，包括施用抗病毒有效量的一种或多种本发明化合物，在被治疗的动物或病人体内抑制病毒的生长或复制。在本发明优选的方法中，本组合物被用于预防或延缓EBV，VSV或HV-8感染在患者体内的发病，尤其是EBV相关的淋巴瘤或癌症，包括患者体内的卡波西肉瘤，包括已经输血的患者和免疫缺损或免疫损伤的患者，例如，AIDS病患者和移植患者，等等。
以这些新化合物为基础的药物组合物包含治疗有效量的，治疗病毒，一般是EBV，VSV或HV-8感染的一种或多种上述化合物，非强制性地与药用添加剂，载体或赋性剂结合。
某些化合物，以药物剂型，也可以用作抑制EBV，VSV或HV-8生长或复制的预防剂。这些特别适合于作为抗-EBV，抗-VSV或抗-HV-8剂。在某些药物剂型中，前药形式，例如，酰化的核苷或含有磷酸酯的核苷可能是优选的。
不受理论限制的同时，我们相信，本发明化合物通过抑制病毒DNA聚合酶，或通过将核苷掺入病毒DNA中导致链终止，从而诱发其对于EBV，VSV或HV-8生长或复制的抑制作用。出人意料的是，本发明化合物，尤其是本发明的5-碘-L-核苷和5-溴-L-核苷类似物呈现出与任何已经在历来的文献中公开的其他核苷不同的抗病毒谱。可以对该独一无二的抗病毒活性提出一个独特的机理。
本发明化合物通过本专业已知的合成方法，并包括各种化学合成方法生产。
附图简要说明附
图1，图解1，描绘了二氧戊环基糖中间体5从L-古洛糖-γ-内酯1的化学合成。
附图2，图解2，描绘了乙酰化二氧戊环基糖衍生物10从1，6-脱水-β-L-古洛吡喃糖4的化学合成。
附图3，图解3，描绘了本发明的5-取代的β-L-二氧戊环基核苷类似物(11，13，15，17，19和21)从二氧戊环基糖衍生物10和保护的5-取代的尿嘧啶碱的化学合成。
附图4是描绘在抗EBV系列中两种最有活性的化合物，(2S，4S)-1-[(羟甲基)-1，3-二氧六环基-4-基]-5-溴代尿嘧啶(β-L-Br-OddU)和(2S，4S)-1-[(羟甲基)-1，3-二氧六环基-4-基]-5-碘代尿嘧啶(β-L-I-OddU)的剂量应答曲线。
附图5是描绘由β-L-Br-OddU在雌性BDF1小鼠体内产生的药物动力学数据。
附图6是描绘由β-L-I-OddU在雌性BDF1小鼠体内产生的药物动力学数据。
附图7是描绘DNA杂交，β-L-I-OddU对DHPG抗HV-8的剂量应答图。
发明详细说明下列定义将用于整个说明书，描述本发明。
术语“患者”用于整个说明书，描述用根据本发明的组合物治疗，包括预防性治疗的动物，优选人类。对于治疗如人的具体动物，特定的感染，病症或病情，术语患者指具体的动物。
术语“EB病毒”或(EBV)用于整个说明书描述在Burkitt’s淋巴瘤的细胞培养物中发现的herpetovirus。结构上，EBV与其他herpetovirus类似-它具有在核衣壳内所含的双螺旋DNA基因组，所述核衣壳被含有病毒糖蛋白的脂质包膜包围。间层蛋白占据了包膜和核衣壳之间的空间。EBV是传染性单核细胞增多症的致病剂。EB病毒也被认识到是B-细胞增殖性疾病，淋巴增殖性综合征，非家族性单一吞噬细胞综合征的致病剂，并与许多病症关联，包括罕见的进行性单核细胞增多症样综合征和艾滋病患者的口毛粘膜白斑病。EBV也与某些类型的癌症如Burkitt’s淋巴瘤，鼻癌，何杰金氏病，EBV-相关的T-细胞淋巴瘤和鼻T-细胞淋巴瘤。某些患者，尤其是免疫系统受抑制的患者，如接受免疫抑制剂治疗的艾滋病患者和器官移植患者，对EBV表现，特别是EBV-相关的淋巴瘤的发展尤其敏感。
术语“带状疱疹病毒”(VZV)用于描述herpesvirus Varicellae，也称为水痘或带状疱疹。VZV是一种herpetovirus并与单纯疱疹病毒在形态学上不同，在人体引起水痘或带状疱疹。水痘是由于病毒的初级感染引起的；带状疱疹是由于相同病毒的二级侵入引起的，或在许多情况下可以由潜伏几年的感染再活化引起的。
术语“疱疹病毒8”或HV-8用于整个说明书描述据信在艾滋病患者体内的卡波西肉瘤的致病剂。HV-8和HHV-8(人疱疹病毒8)是同一种病毒。
术语“药用衍生物”用于整个说明书描述核苷化合物的任何药用盐或前药形式(如酯，磷酸酯或酯的盐)，根据对患者的给药，直接或间接提供核苷化合物或核苷化合物的活性代谢物。一般地，由于尿嘧啶碱的存在，本发明化合物的游离核苷形式或酰基前药形式不直接形成盐。但是，本发明核苷化合物的一-，二-和三-磷酸酯形式将在磷酸部分形成盐。药用盐包括从药用的无机或有机碱和酸衍生的盐。合适的盐包括从碱金属如钾和钠，碱土金属如钙，镁和铵盐衍生的盐，其中大量的其他酸是药学专业公知的。
术语“酰基”用于整个说明书描述在核苷类似物的5’-位(即在二氧戊环部分的游离羟基位)的基团，它含有C1至C20直链，支链或环烷基链。5’位的酰基与5’位的羟基结合产生酯，给药之后，该酯可以裂解产生本发明的游离核苷形式。根据本发明的酰基由结构
-表示，其中R2是C1至C20直链，支链或环烷基链，烷氧基烷基，芳氧基烷基，如苯氧基甲基，芳基，烷氧基，等等。优选的酰基是其中R2是C1至C3的酰基。根据本发明的酰基也包括，例如，苯甲酰基，取代的苯甲酰基，如3-氯苯甲酰基，琥珀酸基，甲磺酰基，己酰基，己酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸或油酸的酰基，等等。本专业技术人员应该认识到，在本发明中具有用途的酰基要么能用于合成目标药用化合物，要么能作为根据本发明的核苷的前药。
术语“磷酸酯”用于整个说明书描述二氧戊环部分的的5’位的单磷酸酯基，它被二酯化而呈现中性，即具有中性电荷。用于本发明的磷酸酯包括由如下结构表示的酯
其中R3选自C1至C20直链，支链或环烷基，烷氧基烷基，芳氧基烷基，如苯氧基甲基，芳基，烷氧基，等等。用于本发明前药形式的优选的单磷酸酯是其中C1至C20是直链，支链烷基，最优选C1至C3烷基的酯。根据本发明的磷酸酯也称为“磷酸二酯(phosophodiester)”基团，该术语作为同意词使用。
术语“抑制有效浓度”或“抑制有效量”用于整个说明书描述基本上或明显抑制敏感病毒，尤其包括EBV，VZV和HV-8的生长或复制的本发明化合物的浓度或量。
术语“治疗有效量”或“治疗上有效的量”用于整个说明书描述在治疗人体EBV，VZV和HV-8感染中治疗有效的本发明化合物的浓度或量。
术语“预防有效量”用于整个说明书描述在人体内预防或延缓EBV，VZV和HV-8感染或相关病症(特别是EBV相关的癌症或淋巴瘤和卡波西肉瘤)的发病时预防有效的本发明化合物的浓度或量。
术语“L-构型”用于整个说明书描述本发明二氧戊环尿嘧啶核苷化合物的化学构型。本发明糖部分的L-构型与大多数天然存在的核苷如胞嘧啶核苷，腺苷，胸苷，鸟苷和尿苷的核糖的D-构型相反。
术语“对映体富集”用于整个说明书描述包括一种核苷的至少约95％，优选地至少约96％，更优选至少约97％，更优选至少约98％，还更优选至少约99％或更高的单个对映体的核苷。除非另外说明，当L-核苷出现在本说明书中时，核苷是对映体富集的核苷。
本发明涉及这一令人吃惊的发现含有二氧戊环部分，具有L-构型(与天然存在的D-构型相反)β-L-二氧戊环基核苷类似物出乎意料地显示出很强的抗EB病毒(EBV)，带状疱疹病毒(VZV)和卡波西肉瘤病毒(也称为疱疹病毒8或HV-8)活性。特别地，本发明化合物显示出对病毒很强的抑制作用，同时对宿主细胞(即动物或人体组织)具有很低的毒性。
本发明也涉及这一出人意料的发现(2S，4S)-1-[(羟基甲基)-1，3-二氧六环基-4-基]-5-溴代尿嘧啶(β-L-Br-OddU)和(2S，4S)-1-[(羟甲基)-1，3-二氧六环-4-基]-5-碘代尿嘧啶(β-L-I-OddU)是具有相对低毒性，极其有效的抗-EBV剂，尤其是与已经显示抗-EBV活性的D-核苷类似物相比。
因此，本发明涉及如下结构的一组化合物
其中R是H，F，Cl，Br，I，CH3或CF3；和R1是H，C1至C20酰基或醚基，磷酸酯基，二磷酸酯基，三磷酸酯基或磷酸二酯基。
在本发明的这方面，R优选地是Br或I，R1是H。最优选地，R是I。
本发明也涉及抑制EB病毒(EBV)，带状疱疹病毒(VZV)和卡波西肉瘤病毒(HV-8)生长或复制的方法，包括使病毒与抑制有效浓度的如下结构的化合物接触
其中R是H，F，Cl，Br，I，CH3或CF3；和R1是H，C1至C20酰基或醚基，磷酸酯基，二磷酸酯基，三磷酸酯基或磷酸二酯基。
在本发明的这一方法方面，R优选地是Br或I，R1最优选地是H。
本发明也涉及治疗患有由EB病毒，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒(HV-8)引起的感染的患者的方法，该方法包括对所说的患者施用治疗有效浓度或量的如下结构的化合物
其中R是H，F，Cl，Br，I，CH3或CF3；和R1是H，C1至C20酰基或醚基，磷酸酯基，二磷酸酯基，三磷酸酯基或磷酸二酯基。
在本发明的此方法方面，R优选地是Br或I，当被EBV感染时，最优选I，当被VZV感染时最优选Br，R1最优选地是H。
本发明化合物最有用的是其抗-EBV，抗-VZV和抗-HV-8活性。本发明化合物也有用的是其他抗病毒活性。另外，这些组份也在作为其他核苷或核苷类似物的化学合成中间体时发现了用途，而这些其它核苷或核苷类似物则可用作治疗剂或其他目的，包括在生物试验中的用途，或作为生物学探针。优选地，这些化合物用作新的抗-EBV，抗-VZV或抗-HV-8剂。
一般说来，最优选的本发明抗病毒化合物包括对宿主细胞更少细胞毒性，而对靶病毒更有活性的化合物。某些化合物，以药物剂型，可被用作预防剂。这些可能是特别合适的抗-EBV，抗-VZV或抗-HV-8剂。由于其对患者特别低的毒性和优秀的抗病毒活性，对于治疗和/或预防EBV，VZV和HV-8感染，β-L-Br-OddU和β-L-I-OddU是特别有效的抗-预防化合物。
本发明化合物通过本专业已知的合成方法生产，包括各种在下面的实施例中明显地更详细说明的合成方法。一般地，本发明化合物通过预先合成的核苷碱与合适的二氧戊环基合成子缩合而合成，将最终给出具有所需的L-构型的核苷类似物。在某些情况下，合成途径可偏离特定核苷类似物的一般合成途径。
在本发明各种组份的化学合成期间，本专业技术人员可以不需要过分试验而实施本发明。具体地，本专业技术人员将认识在碱所需的位置引入特定取代基或在糖部分的所需位置引入取代基的各种步骤。另外，用于“保护”官能团如羟基或氨基等等，以及使该官能团“脱保护”的化学步骤，在合成的情况下将被认为是合适的。大量保护基可被用于本发明。在将任何一个或多个酰基引入核苷的5’位(或尿嘧啶碱)的情况下，可用本专业公知的标准技术。5’-一，二-或三磷酸酯，或磷酸二酯(中性前药形式)，也可通过本专业公知的方法合成。
一般说来，本发明化合物的合成通过首先合成合适的二氧戊环合成子，然后使取代的碱与二氧戊环合成子缩合。用于合成本发明化合物的适当的合成途径可以在图解1-3中找到，并一般在实施例中描述。各种相当的合成方法可用于合成本化合物。
本发明的治疗方面涉及治疗人体EBV，VZV或HV-8感染的方法，包括对需要治疗的患者施用抗病毒有效量的本发明化合物，抑制病毒的生长或复制。
在本发明优选的方法方面，本发明组合物被用于预防或延缓EBV-相关的淋巴癌或癌症或患者体内的卡波西肉瘤，包括已经输血的患者和免疫缺损或免疫损伤的患者，例如，AIDS病患者和移植患者，等等。该方法包括这类患者施用预防有效量(一般与治疗有效量相同)的一种或多种本发明组合物，延缓或预防EBV，VZV或HV-8的感染。
基于这些新化合物的药物组合物包括用于治疗病毒，尤其是EBV，VZV或HV-8感染，治疗有效量的上述化合物，非强制性地与药用添加剂，载体或赋性剂结合。本专业技术人员应该认识到，治疗有效量将随感染或被治疗的病症，其病情，所用治疗方案，所用药剂的药物动力学，已经被治疗的患者(动物或人)而变化。
在本发明的药物方面，本发明化合物优选地与药用载体混合配制。一般地，药物组合物以口服给药的形式是优选的，但某些制剂可以经肠胃外，静脉内，肌内，经皮，颊内，皮下，栓剂或其他途径给药。静脉内和肌内制剂优选地在无菌食盐水中给药。当然，本专业技术人员可以在本说明书的指导下修改配方，提供许多特殊给药途径的制剂，不使本发明的组合物不稳定或损害其治疗活性。具体地，本发明化合物使其在水或其他载体中更易溶解的修饰，例如，可以容易地通过本专业技术人员公知的很小的修改(盐配方，酯化，等等)而完成。修改给药途径和具体化合物的剂型以使本发明化合物的药物动力学在患者体内达到最佳效果，也是普通技术人员已知的。
在某些药物剂型中，化合物的前药形式，特别包括酰基化(乙酰化或其他)和醚衍生物，吡啶酯，磷酸酯和本发明化合物的各种盐形式，是优选的。本专业技术人员将知道如何将本发明化合物修饰为前药形式以促进活性化合物在宿主器官或患者体内向靶位的输送。按程序操作者也会采用前药形式的有用的药物动力学参数的优点，如果可以应用，将本发明化合物输送到宿主器官或患者体内的靶位以使化合物的效果达到最佳。
包括在本发明治疗活性制剂内的化合物的量是治疗感染或病症，在优选的方案中是EBV，VZV或HV-8感染有效量的。一般说来，本发明化合物在药物剂型中的治疗有效量通常在约0.1mg/kg至约100mg/kg或更高，更优选地，略少于约1mg/kg至约25mg/kg患者体重，或者更重要地，取决于所用化合物，所治疗的病症或感染和给药途径。在用β-L-Br-OddU或β-L-I-OddU治疗EBV，VZV或HV-8的情况下，根据药剂在患者体内的药物动力学，化合物优选地以约1mg/kg至约25mg/kg患者体重范围的量给药。此剂量范围一般产生活性化合物有效的血中浓度，其范围为约0.05至约100微克/cc血液。本发明组合物的预防性或预防有效量与前面给出的治疗有效量的浓度范围相同，并且往往与治疗有效量相同。
活性化合物的给药可以在连续(静脉滴注)至每天几次口服给药(例如，Q.I.D.)的范围内，并包括口服，局部，肠胃外，肌内，静脉内，皮下，经皮(可包括渗透促进剂)，颊内和栓剂给药，和其他给药途径。肠衣口服片剂也可用于在口服给药途径中促进化合物的生物共容性。
为了制备本发明的药物组合物，优选地根据常规药物配合技术，将治疗有效量的一种或多种本发明化合物与药用载体充分混合而生产药剂。载体可以根据需要给药，例如口服或肠胃外的制剂形式，采取很多形式。在制备口服剂型的药物组合物时，可以使用任何常用的药物介质。因此，对于液体口服制剂如悬浮剂，弛剂和溶液，合适的载体和添加剂包括水，甘醇，油，醇，调味剂，防腐剂，着色剂等等可被使用。对于固体口服制剂如粉剂，片剂，胶囊，和对于固体制剂如栓剂，合适的载体和添加剂包括淀粉，糖载体，如葡萄糖，甘露糖醇，乳糖和相关载体，稀释剂，成粒剂，润滑剂，黏合剂，崩解剂等等也可使用。如果需要，片剂或胶囊可以包肠衣或通过标准技术缓释。这些剂型的使用可以使化合物在患者体内的生物共容性明显增加。
对于肠胃外制剂，载体通常包括无菌水或氯化钠水溶液，尽管其他成分，包括帮助分散的成分，也可被包括。当然，在使用无菌水并保持无菌的同时，组合物和载体也必须被灭菌。也可制备可注射的悬浮液，在这种情况下，可以应用合适的液体载体，悬浮剂等等。
也可以通过常规方法制备脂质体悬浮液(包括瞄准病毒抗原的脂质体)以生产药用载体。这对于输送本发明核苷化合物的游离核苷，酰基核苷或磷酸酯前药形式是合适的。
在本发明特别优选的方案中，化合物和组合物被用于治疗，预防或延缓哺乳动物病毒感染的发病，尤其是人体EBV，VZV和HV-8感染。在其优选的方案中，化合物被用于治疗EBV，VZV和HV-8感染，尤其包括慢性EBV感染。优选地，为了治疗，预防或延缓EBV，VZV和HV-8感染的发病，组合物可被以口服剂型，以约250微克至最高约500mg或更高的量给药，每天至少一次，优选地，最高一天四次。本发明化合物优选地被口服给药，但可被肠胃外，局部或以栓剂形式给药。
本发明化合物，由于其对宿主细胞的低毒性，可以有利地预防性应用，预防EBV，VZV和HV-8感染，或预防与病毒感染相关的临床症状的发生。因此，本发明包括预防性治疗病毒感染，尤其是EBV，VZV和HV-8感染的方法。在本发明的这一方面，本发明组合物被用于预防或延缓EBV，VZV和HV-8感染，或EBV-，VZV-或HV-8-相关的疾病如淋巴癌或癌症，包括患者体内的卡波西肉瘤，包括已进行输血的患者和免疫缺损或无免疫应答的患者，例如艾滋病患者和移植患者，等等。此预防方法包括对需要这类治疗或处于EBV-，VZV-或HV-8-相关的病症或疾病危险的患者施用对于减轻，预防或延缓病毒感染发病有效量的本发明化合物。在本发明的预防性治疗中，所用抗病毒化合物是低毒性，优选地对患者无毒是优选的。在本发明的此方面，所用化合物是抗病毒最有效的，并且对患者显示出最小的毒性是特别优选的。在β-L-Br-OddU和β-L-I-OddU的情况下，更优选地在EBV，β-L-I-OddU的情况下，更优选地在VZV，β-L-Br-OddU的情况下，这些化合物可以在与作为预防EBV，VZV和HV-8增殖，或者延缓在临床症状中显示的EBV，VZV和HV-8感染的发作的预防剂相同的剂量范围(即，约250微克至最高约500mg或更高，每天1至4次，口服剂型)给药而用于治疗。
另外，本发明化合物可以单独给药或与其他药剂，特别包括本发明其他化合物结合给药。本发明某些化合物对于通过降低代谢或使为些预定效应而共同给药的其他化合物等失活而增加本发明某些药剂的生物活性是有效的。
在特别优选的药物组合物和治疗EBV，VZV和HV-8感染的方法中，抑制有效量的β-L-Br-OddU或β-L-I-OddU对患有这类感染的患者给药，治疗感染并减轻这类感染的病症。
在特别优选的药物组合物和治疗EBV感染的方法中，抑制有效量的β-L-I-OddU对患有EBV感染的患者给药，抑制感染并减轻这类感染的病症。
在特别优选的药物组合物和治疗VZV感染的方法中，抑制有效量的β-L-Br-OddU对患有VZV感染的患者给药，抑制感染并减轻这类感染的病症。
在不受理论限制的同时，我们相信，本发明化合物首先通过抑制病毒DNA聚合酶，或通过将核苷化合物掺入病毒DNA中导致链终止，从而诱发其对病毒生长或复制的抑制作用。
本发明现在在下列实施例中，纯粹以举例说明的方式进行描述。本专业技术人员应该懂得，这些实施例不在任何意义上限制本发明范围，细节的变化可以在不偏离本发明精神和范围的情况下进行。
实施例L-二氧戊环基嘧啶核苷的合成一般地，本发明化合物根据下述化学合成法合成。用于合成本发明化合物的合成化学方法学代表文献方法的改进。在下面实施例中给出了参考，从该参考可以看出，相关的化学反应已经被改进以生产本发明化合物。
熔点在Mel-temp II实验装置上测定并且未经校正。NMR谱在Bruker250或Bruker 400 Fourier变换光谱仪上记录；化学位移以每百万分之几(δ)报道，信号以s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，和dd(双倍双峰)表示。UV谱用Beckman DU-7分光光度计获得。旋光度用JASCO DIP-370数字旋光仪测量。TLC用从Analtech Co.购买的Uniplates(硅胶)进行。元素分析用Atlantic Microlab，Inc.，Norcross，GA进行。干燥的1，2-二氯乙烷，二氯甲烷，乙腈，苯和吡啶通过在使用之前从CaH2中蒸出而获得。当溶液变红紫时，干燥的THF通过从钠和二苯酮中蒸出而获得。
2，3，5，6-二异亚丙基-L-古洛糖酸-γ-内酯(2)的合成往配有机械搅拌器的5L三颈烧瓶中依次加入L-古洛糖酸(gulono)-γ-内酯1(100g，0.56mol)，无水硫酸铜(279g)和无水丙酮(2.5L，用4分子筛干燥)。开始搅拌后加入浓硫酸(10ml)。反应混合物在氮气氛中搅拌24小时。将混合物用固体碳酸钠中和并过滤。滤液浓缩至干，残余物分配在二氯甲烷(300mL×3)和水(300mL)之间。合并的有机层用水(300mL)和饱和碳酸钠(250mL)洗涤，硫酸钠干燥。过滤，浓缩至浆状物，加入二氯甲烷(200mL)以溶解残余物，然后将己烷加入直至溶液变浑。将固体滤出并用己烷洗涤。将三部分合并，真空干燥。总共得到101.84g产品2(70.3％，Rf＝0.77，氯仿/甲醇，10∶1)。
2，3，5，6-二异亚丙基-L-古洛糖酸-γ-乳醇(3)的合成往在烘箱中干燥然后用氮气清洗的3L三颈烧瓶中加入无水THF(1L)和保护的内酯2(101.84g，0.39mol)。将溶液搅拌并用干冰-丙酮冷浴冷却。溶液温度降至-78℃后，在氮气氛中通过滴液漏斗滴加DIBAL-H(500mL，1M己烷)。将混合物搅拌2小时，然后加入甲醇(140mL)淬灭反应。形成一个大白块。加入饱和的酒石酸钠钾直至固体消失。分出有机层，水层用乙酸乙酯(300mL×2)萃取。合并的有机层用水(400mL)，饱和碳酸氢钠(250mL)和食盐水(250mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸发溶剂，给出白色固体，将其用柱子(硅胶，甲醇/二氯甲烷，5-10％)纯化给出产品3(95.05g，93％，Rf＝0.64，甲醇/氯仿，1∶10)1，6-脱水-β-L-古洛吡喃糖(gulopyranose)(4)往2L烧瓶中加入乳醇3(95g，0.36mol)和0.5N盐酸(950mL，0.47mol)。将溶液回流搅拌24小时，然后将混合物冷却，并用Dowex-2树脂(HCO3-型)中和至pH＝6，并鼓入空气以除去产生的二氧化碳。将混合物过滤，树脂用水(1000mL)充分洗涤。将合并的滤液减压浓缩至干，产生的残余物与绝对乙醇共蒸发，直至形成泡沫状固体。将固体用柱子(硅胶，甲醇/二氯甲烷10-25％)纯化给出浅黄色固体，将其从绝对乙醇中重结晶产生无色固体4(25.2g，42.2％，Rf＝0.62，甲醇/氯仿1∶3，m.p.142-145℃)。用50％甲醇-二氯甲烷从柱子上洗下另一产物，L-古洛糖(Rf＝0.25，甲醇/氯仿)，并浓缩为黑色残余物，将其在同样反应条件下循环给出4(13.5g，22.6％)。总产率为64.8％。1HNMR(DMSO-d6)δ3.22-3.68(m，4H，H-2，-3，-4，and-6a)，3.83(d，J6b，6a＝7.25Hz，1H，H-6b)，4.22(pseudot，J5，6a＝4.61 and 4.18Hz，1H，H-5)，4.46(d，J2OH，2＝6.59Hz，1H，2-OH可用D2O交换)，4.62(d，J3OH，3＝5.28Hz，1H，3-OH，可用D2O交换)，5.07(d，J4-OH，4＝4.84Hz，1H，4-OH，可用D2O交换hD2O)，5.20(d，J1，2＝2.19Hz，1H，H-1).
(1’S，2S，4S)-4-[(1，2-二羟基-1，2-O-异亚丙基)乙基]-2-(羟基甲基)二氧戊环(6)在0℃，10分钟内，将NaIO4(5.5g，25.7mmol，1.4当量)水溶液通过滴液漏斗滴加到4(3g，18.5mmol)的甲醇(100ml)溶液中，将混合物机械搅拌15分钟。加入硼氢化钠(2.1g，56mmol)，将反应混合物再搅拌10分钟。滤出白色固体，并将固体用甲醇(100mL)洗涤。合并的滤液在0℃通过0.5N盐酸中和，然后浓缩至干，残余物与绝对乙醇(20mL×5)共蒸发，再真空干燥过夜。加入甲醇(100mL)以溶解残余物，滤出白色固体，将滤液浓缩至干，然后加入干燥的丙酮(300mL)，p-TsOH.H2O(4g)。将反应混合物搅拌2小时，然后用三乙胺中和。过滤，浓缩为浆状物，用柱子(硅胶，乙酸乙酯-己烷，1∶1)纯化给出6(1.6g，42％，Rf＝0.71，乙酸乙酯/Hx，2∶1)无色油状物。1HNMR(DMSO-d6)δ1.25 and 1.31(2s，2x3H，异亚丙基)，3-39(dd，JCH2OH，H2＝3.86Hz，JCH2OH，OH＝6.09Hz，2H，-CH2OH)，3.61-4.10(m，6H，H-4，-5，-1′and-2′.)，4.82(t，JH2，CH2OH＝3.87Hz，1H，H-2)，4.90(t，JOH，CH2OH＝6.09Hz，1H，-OH，可用D2O交换)(1’S，2S，4S)-4-[(1，2-二羟基-1，2-O-异亚丙基)乙基]-2-[(苯甲酰氧基)甲基]二氧戊环(7)在0℃，氮气氛中，将苯甲酰氯(4.4mL，37.5mmol)经注射器滴加到6(5.7g，28mmol)的吡啶-二氯甲烷(1∶2，80mL)溶液中。将温度升至室温。搅拌2小时后，TLC指示反应完成，用甲醇(10mL)淬灭反应。将溶液浓缩至干，产生的残余物溶于二氯甲烷(300mL)，并用水(100ml×2)，食盐水(100mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，蒸发给出黄色浆状物，通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/Hx，5-20％)纯化，给出7(7.39g，86％，Rf＝0.48，乙酸乙酯/Hx，1∶3)无色油状物。
1HNMR(CDCl3)δ1.35and 1.44(2s，2x3H，异亚丙基)，3.77-4.51(m，8H，H-4，H-5，H-1′，CH2OBz)，5.29(t，J＝3.78Hz，1H，H-2)，7.40-7.60，8.05-8.09(m，3H，2H，OBz).
(1’S，2S，4S)-4-(1，2-二羟基乙基)-2-[(苯甲酰氧基)甲基]二氧戊环(8)搅拌下，往7(13.62g，45mmol)的甲醇(30mL)溶液中加入p-TsOH(1.3g，6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，TLC显示反应完成。将溶剂蒸发至一半体积，加入甲醇(50mL)和p-TsOH(0.65g)。再搅拌1小时后，反应混合物用三乙胺中和并蒸发至干。将残余物通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/Hx，10-15％)纯化给出8(9.8g，83％，Rf＝0.31，乙酸乙酯/Hx，2∶1)无色油状物。1HNMR(DMSO-d6)63.43(m，2H，H-2′)，3.67-4.1(m，4H，H-4，-5，-1′)，4.32(d，J＝3.73Hz，2H，CH2OBz)，4.60(t，J＝5.72Hz，2＇-OH，可用D2O交换)，5.23(t，J＝3.96H.z，1H，H-2)，7.45-7.7，7.93-8.04(m，3H，2H，OBz).
(2S，4S)-和(2S，4R)-4-乙酰氧基-2-[(苯甲酰氧基)甲基]二氧戊环(10)将NaIO4(10.2g，48mmol)的水(120mL)溶液通过滴液漏斗滴加到8(3.1g，11.0mmol)的四氯化碳-乙腈(1∶1，160mL)溶液中。然后加入RuO2.H2O(0.03g)。将反应混合物搅拌5小时，TLC显示反应完成，用硅藻土垫滤出固体。将滤液蒸发至1/3体积，然后加入(150mL)，分出有机层，水层用二氯甲烷(50mL×3)萃取。合并的有机层用食盐水(100mL)洗涤，硫酸镁干燥。用硅藻土垫过滤，然后蒸发至干。浆状物与干燥的THF(20mL×5)共蒸发，再真空干燥过夜给出粗产物9(2.9g)。
将粗产物9溶于干燥的THF(60mL)，然后在氮气氛中加入Pb(OAc)4(5.48g，12.4mmol)和吡啶(0.83mL，10.3mmol)。混合物搅拌1小时后，TLC显示反应完成。用硅藻土垫滤出固体并用乙酸乙酯(100mL)洗涤。将合并的有机层蒸发至干，然后通过硅胶柱层析(乙酸乙酯/Hx，30-35％)纯化给出异头物混合物10(1.93g，63％，Rf＝0.64和0.54，己烷/乙酸乙酯，2∶1)无色油状物。
1HNMR(CDCl3)δ1.998，2.11(2s，3H，Oac)，3.93，4.33(m，2H，H-5)，4.43，4.48(2d，J＝3.73，3.74Hz，2H，CH2OBz)，5.46，5.55(2t，J＝4.18，3.63Hz，1H，H-2)，6.42(m，1H，H-4)，7.33-7.59，8.00-8.15(m，3H，2H，-OBz).
(2S，4S)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]尿嘧啶(11)和(2S，4R)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]尿嘧啶(12)将尿嘧啶(0.63g，5.6mmol)和HMDS(25mL)，硫酸铵(5mg)的混合物在氮气氛中搅拌5小时。所产生的清亮的溶液在无水条件下真空浓缩得到油状物(甲硅烷基化的尿嘧啶)，将其溶于干燥的DCE(10mL)。在氮气氛中加入二氧戊环乙酸酯10(1g，3.7mmol)，然后加入TMSOTf(1.4mL)。混合物在室温下搅拌2小时，然后通过加入饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭。将反应混合物再搅拌30分钟。混合物用水(50mL)和二氯甲烷(100mL)稀释。分出有机层，水层用二氯甲烷(80mL×3)萃取。合并的有机层饱和碳酸氢钠水溶液(150mL)，水(100mL)洗涤，干燥(硫酸镁)。过滤，蒸发溶剂给出白色固体(0.936g，产率81％)。然后在室温下将混合物用氨的甲醇溶液处理24小时，然后蒸发至干。残余物通过硅胶柱层析纯化，用甲醇/氯仿作洗脱剂给出13异构体11，异构体12和未分开的两种异构体的混合物。β-异构体11Rf＝0.31(MeOH/CHCI3，3∶10).UV(H2O)(pH7)261.0nm(ε10432)，(pH11)260.5nm(ε7931)，(pH2)261.0nm(ε10651)[(α]D25＝E 20.93(c0.33，MeOH)，1HNMR(DMSO-d6)δ11.32(s，NH)，7.80(d，J＝8.2Hz，1H，H-6)，6.19(d，J＝4.95Hz，1H，H-4′)，5.61(d，J＝7.98Hz，1H，H-5)，5.18(t，1H，OH，可用D2O交换)，4.90(t，J＝2.75Hz，1H，H-2＇)，4.02-4.05(m，2H，H-5′)，3.62(d，J＝2.75Hz，2H，H-6′)，计算值C8H10O5N2C，44.86；H，4.67；N，13.08.测定值C，44.94；H，4.78；N，13.02.α异构体12Rf＝0.35(MeOH/CHCl3，3∶10).UV(H2O)(pH7)262.0nm(ε10684)，(pH11)261.5nm(ε8246)，(pH2)261.5nm(ε11208)[α]D25＝-3.28(c0.72，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.37(br.s，NH)，7.58(d，J＝7.92Hz，1H，H-6)，5.61(d，J＝8.17Hz，1H，H-5)，6.13(dd，J＝5.43Hz，J＝2.98Hz，1H，H-4′)，5.43(t，J＝3.6Hz，1H，H-2′)，5.01(t，J＝6.02Hz，OH，可用D2O交换)，4.26(dd，J＝5.6Hz，J＝9.4Hz，1H，H-5＇)，4.05(dd，J＝2.9Hz，J＝9.3Hz，1H，H-5′)，3.42(m，2H，H-6＇).计算值C8H10O5N2C，44.86；H，4.67；N，13.08.测定值C，44.77；H，4.65；N，13.00.
相同的工艺被用于类似地合成其他5-取代的核苷。
下面给出其余L-核苷类的分析数据(2S，4S)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-氟尿嘧啶(13)和(2S，4R)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-氟尿嘧啶(14)β-异构体13的数据Rf＝0.54(MeOH/CHCI3 1∶4).UV(H2O)(pH7)268.0nm(ε9966)；(pH11)268.0nm(ε7822)；(pH2)268.0nm(ε10128).[α]D25＝7.73(c0.25，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.85(NH)，8.24(d，1H，J＝7.17Hz，H-6)，6.17(d，1H，J＝5.58Hz，H-4＇)，5.33(t，1H，5′-OH 可用D2O交换)，4.90(s，1H，H-2′)，4.28(d，J＝4.0Hz，1H，H-5′)，4.04(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H，H-5′)，3.68(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2FC，41.38；H，3.88；N，12.07.测定值C，41.62；H，4.01；N，11.82.α-异构体14的数据Rf＝0.53(MeOH/CHCI3，1∶4).UV(H2O)(pH7)268.5nm(ε10214)，(pH11)268.0nm(ε8212)，(pH2)268.5nm(ε12223).[α]D25＝5.81(c，0.29，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.90(NH)，7.88(d，J＝6.82Hz，1H，H-6)，6.10(m，1H，H-4′)，5.49(t，1H，J＝3.87Hz，H-2′)，5.00(t，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.03-4.29(m，2H，H-5′)，3.33(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2FC，41.38；H，3.88；N，12.07.FoundC，41.45；H，3.87；N，12.04.
(2S，4S)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-氯尿嘧啶(15)和(2S，4R)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-氯尿嘧啶(16)β-异构体15的数据Rf＝0.61(MeOH/CHCl3，1∶4).UV(H2O)(pH 7)275.0nm(ε9018)，(pH11)274.5nm(ε7408)，(pH2)276.0nm(ε10432).[α]D25＝2.98(c 0.26，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)6 11.86(NH)，8.37(s，1H，H-6)，6.17(d，J＝5.23Hz， H-4′)，5.37(t，J＝5.65Hz，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.92(s，1H，H2′)，4.02-4.34(m，2H，H-5′)，3.66(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2ClC，38.63；H，3.62；N，11.27.测定值C，38.39；H，3.78；N，11.02.α-异构体16的数据Rf＝0.56(MeOH/CHCl3，1∶4).UV(H2O)(pH7)276.0nm(ε9448)，(pH11)274.5nm(ε8276)，(pH2)276.5nm(ε9509).[α]D25＝5.28(c0.31，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.67(NH)，7.68(s，1H，H-6)，5.90(d，J＝4.0Hz，1H，H-4′)，5.31(t，J＝4.0Hz，1H，H-2′)，4.76(t，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.10(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H，H-5＇)，3.92(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H，H-5′)，3.24(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2ClC，38.63；H，3.62；N，11.27.测定值C，38.45；H，3.75；N，11.13.
(2S，4S)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-溴尿嘧啶(17)和(2S，4R)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-溴尿嘧啶(18)β-异构体17的数据RF＝0.61(MeOH/CHCI3，1∶4).UV(H2O)(pH7)277.0nm(ε7229)，(pH11)276.0nm(ε6981)，(pH2)278.5nm(ε9939).[α]D25＝4.61(c0.28，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.83(NH)，8.45(s，1H，H-6)，6.16(d，J＝5.05Hz，1H，H-4′)，5.36(t，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.92(s，1H，H-2′)，4.01-4.34(m，2H，H5′)，3.66(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2Br0.7CH3OHC，33.10；H，3.74；N，8.87.测定值C，33.50；H，3.34；N，8.46.
α-异构体18的数据Rf＝0.58(MeOH/CHCI3，1∶4).UV(H2O)(pH7)279.0nm(ε11825)，(pH11)276.0nm(ε8438)，(pH2)279.0nm(ε11801).D25＝3.67(c0.29，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.88(NH)，7.92(s，1H，H-6)，6.07(dd，1H，J＝3.17Hz，5.4z，H-4′)，5.50(t，J＝4.0Hz，1H，H-2′)，5.01(t，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.27(m，2H，H-5′)，3.41(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2BrC，32.77；H，2.73；N，9.56.测定值C，32.71；H，3.12；N，9.45.
(2S，4S)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-碘尿嘧啶(19)和(2S，4R)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-碘尿嘧啶(20)β-异构体19的数据Rf＝0.77(MeOH/CHCl3，1∶4).UV(H2O)(pH7)285.0nm(ε6628)，(pH11)279.0nm(ε5593)，(pH2)287nm(ε7350).[α]D25＝7.60(c0.25，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.64(NH)，8.42(s，1H，H-6)，6.16(d，1H，J＝4.0Hz，H-4′)，5.30(br.s，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.93(s，1H，H-2′)，4.04-4.31(m，2H，H-5′)，3.66(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2lC，28.23；H，2.65；N，8.24.测定值C，28.36；H，2.66；N，8.18.α-异构体20的数据Rf＝0.75(MeOH/CHCl3，1∶4).UV(H2O)(pH7)287.5nm(ε8946)，(pH11)278.5nm(ε6383)，(pH2)287.5nm(ε9049).[α]D25＝-6.75(c0.33，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.64(NH)，7.75(s，1H，H-6)，5.92(dd，1H，J＝4.0Hz，H-4′)，5.32(t，J＝4.0Hz，1H，H-2′)，4.78(t，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.12(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H，H-5′)，3.95(dd，J＝4.0，8.0Hz，1H，H-5′)，3.25(m，2H，H-6′).
计算值 C8H9O5N2lC，28.23；H，2.65；N，8.24.测定值C，28.23；H，2.73；N，8.17.
(2S，4S)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-三氟甲基尿嘧啶(21)和(2S，4R)-1-[2-(羟基甲基)-1，3-二氧戊环-4-基]-5-三氟甲基尿嘧啶(22)β-异构体21的数据Rf＝0.60(MeOH/CHCl3，1∶4).UV(H2O)(pH 7)261.0nm(ε10657)，(pH11)259.0nm(ε7334)，(pH2)261.0nm(ε11036)[α]D25＝-5.94(c0.27，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)6 11.88(NH)，8.84(s，1H，H-6)，6.17(d，J＝4.9Hz，1H，H-4′)，5.40(t，J＝5.47Hz，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.94(s，1H，H-2′)，4.03-4.39(m，2H，H-5′)，3.68(m，2H，H-6′).
计算值 C9H9O5N2F3.0.2EtOHC，38.73；H，3.50；N，9.61.测定值C，38.92；H，3.36；N，9.54.
α-异构体22的数据Rf＝0.58(MeOH/CHCI3，1∶4).UV(H2O)(pH7)260.5nm(ε12221)，(pH11)259.5nm(ε6750)，(pH2)261.0nm(ε12342).[α]D25＝-2.59(c0.26，MeOH).1HNMR(DMSO-d6)δ11.76(NH)，7.80(s，1H，H-6)，5.91(dd，1H，J＝4.0Hz，H-4′)，5.32(t，J＝4.0Hz，1H，H-2′)，4.82(t，1H，5′-OH，D2O可交换)，4.00-4.18(m，2H，H-5′)，3.31(m，2H，H-6′).
计算值 C9H9O5N2F3.O.1H2O，38.05；H，3.24；N，9.86.测定值C，37.75；H，3.31；N，9.80.
L-核苷类似物的生物活性L-OddT被发现如L-FMAU一样是抗EBV活性的。在我们的研究中，当L-FMAU的5-甲基被溴基团取代时，抗-EBV活性实际降低。这意味着卤素取代尿嘧啶碱5-位的甲基将实际降低尿苷L-核苷的活性。相反地，当L-OddT的5-甲基被溴基团取代时，抗-EBV活性实际增加。这是一个出人意料的结果。更详细的构效关系和L-I-OddU和L-Br-OddU的生物活性在下面给出。
操作细胞培养高产量的产生EBV的从人P3HR1细胞衍生的细胞系H1被用于此研究中。细胞在用10％透析过的胎牛血清和100μg/ml卡拉霉素补充的PRMI培养基中培养，并在37℃在含有5％CO2的润湿的培养器中生长。
H1细胞与药物接触在开始处理之前，H1细胞保持对数期生长两天。将H1细胞以每孔2×105的密度在有或没有药物处理的2ml新鲜培养基中被接种到24孔板上，并在37℃温育5天。在药物处理的周期之后，将细胞成丸并被用于通过狭线印迹鉴定测定药物对EBV DNA的抑制作用。
狭线印迹鉴定用各种核苷类似物(如下给出)处理过的总共4×105H1细胞通过冻融3次溶解于400μl 10mM Tris-HCl(pH 7.5)中。将细胞溶胞产物用核糖核酸酶A(以50μg/ml的最终浓度)在37℃处理30分钟，然后用蛋白酶K(以100μg/ml的最终浓度)在55℃处理2小时。通过在pH 8.2调节最终浓度为0.4N/10mMEDTA使样品变性。在100℃水浴中加热10分钟，样品用多支管点在带正电荷的尼龙膜上。然后α-32P-dCTP标记的EBV ECORIC碎片被用作DNA杂交的探针。剥离EBV ECORIC探针后，同样的膜用人AluDNA(BAMH1碎片)再探测。自体放射照相的结果通过密度计分析。在处理过的H1细胞中的EBV DNA的量根据EBV DNA与Alu DNA的比例，与未处理的对照H1细胞相比较而测定。除去Alu DNA探针后，同样的膜被用于通过与线粒体DNA探针再杂交而鉴定对线粒体的毒性。参见，例如，Yao，et al.，Antimic.Agents and Chemo.，July，1993，p.1420-1425；Yao，et al.，Biochem.Pharm.，Vol.51，941-947(1996)(EBV检测)；Doong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.88，8495-8499(十月，1991)；和Bridges，et al.，Biochem.Pharm.，Vol.51，731-736(细胞毒性和mt DNA检测)。
L-Br-OddU和L-I-OddU在BDF1小鼠体内的药物动力学小鼠通过口服(po)，腹膜内(ip)和静脉内(iv)给药50mg/kg用L-Br-OddU处理。在附图5指示的时间之后，将血液从雌性BDF1小鼠的后眶丛导入肝素化的毛细管。通过离心将血浆与形成的元素分离。然后将100μl血浆与等体积的30％三氯乙酸混合，并在冰中保持10分钟。离心后，将上层清液移入一清洁的试管中，并将100μl三辛基胺∶氟利昂(45-55％)的混合物与样品混合以萃取酸。将水相移入一清洁的试管中并再用三辛基胺∶氟利昂混合物萃取。然后将50μl中和过的水相注射到Perkin Elmer HPLC体系中。将样品用水的isocratic溶剂体系以每分钟2ml从Altech C18柱洗脱。未知样品的浓度通过与标准的已知浓度比较而测定。
在L-I-OddU的情况下，雌性BDF1小鼠在时间为零时口服给药10mg/kg L-I-OddU。然后在附图6指示的时间，将肝素化的血液样品从后眶丛抽出。离心除去形成的元素。然后通过加入三氯乙酸萃取血浆，上层清液通过混合的三辛基胺-氟利昂中和。含水样品部分通过HPLC分离，用Beckman ODS柱，0.03N乙酸/2.5％乙腈作溶剂。然后将血浆中的浓度与可靠的对照比较。
(1)L-二氧戊环尿苷类似物抗EBV，细胞生长，和线粒体DNA(mtDNA)含量的构效关系因为L-OddT被发现与L-FMAU一样的抗EBV活性，如上所述合成的含有取代5-CH3的卤素或氢的结构类似物被用于研究其抗EBV细胞生长活性和对mt DNA(如上所述)的细胞毒性。主要结果示于如下，最有活性的两种抗EBV化合物的剂量应答曲线示于附图4。
表2缩写R抗-EBV EC50EC50μM 细胞毒性 mt DNA含量μM IC50μMID50μML-OddU H ＞50 --＞100 无活性L-F-OddUF 50--＞100 无活性
L-Cl-OddU Cl 3 --＞100 无活性L-Br-OddU Br 0.22.0 ＞100 无活性L-I-OddUI 0.10.4 ＞100 无活性L-CF3-OddU CF33 --＞100 无活性L-OddT CH3-5 ------D-I-OddUI 无活性 ------D-Br-OddU Br 无活性 ------L-Br-OddC 无活性 ------ddC无活性 200.02DHPG 575无活性结论L-Br-OddU和L-I-OddU是被试验的最有效的抗-EBV化合物。它们对于线粒体或核DNA合成几乎没有作用。这由其对线粒体DNA含量和细胞生长没有作用和没有诱导在药物处理过的培养物的培养基中乳酸的积累而反映。其具有天然D-构型的对映体的抗EBV活性小得多。而且，L-Br-OddC和L-I-OddC也没有抗EBV活性。
(2)L-I-OddU的抗病毒活性谱L-I-OddU抗其他病毒生长的活性被试验。主要结果示于如下。
表3
用于HSV-1，HSV-2和CMV的蚀斑减少检测已经被描述过。参见，Gao，et al.，Antimic.Agents and Chemo.，May，1990，p.808-812(HSV-斑)；Cheng，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.80，2767-2770(May 1983)(CMV蚀斑减少鉴定)。试验抗EBV，HBV，和HIV的方法如前所述应用。参见Yao，et al.，Antimic.Agents and Chemo.，July，1993，p.1420-1425；Yao，et al.，Biochem.Pharm.，Vol.51，941-947(1996)(EBV鉴定)；Doong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.88，8495-8499(十月，1991)；Mellors，et al.，Molecular Pharm.，41446-451(1992)和Bridges，et al.，Biochem.Pharm.，Vol.51，731-736(HIV鉴定)。
与抗EBV和HBV活性的L-FMAU不同，L-I-OddU只具有很高的抗EBV活性，其EC50值比L-FMAU至少低四倍。值得注意的是，L-I-OddU显示出很低的抗HBV活性。L-I-OddU的抗病毒谱与至今文献中所述的任何抗病毒化合物都不相同。也表示该化合物的作用是对EBV专一的。
(3)L-I-OddU和L-Br-OddU抗EBV复制的剂量应答将H1细胞以指示的剂量与这两种化合物接触5天。药物处理过的细胞的EBV DNA含量通过如上所述的狭线印迹杂交技术估计，并与无药物的细胞比较。L-I-OddU抗EBV DNA合成方面比L-Br-OddU稍强。这些类似物的剂量应答曲线在附图4中给出。
(4)L-I-OddU和L-Br-OddU在不同pH的稳定性为了试探用L-I-OddU和L-Br-OddU口服治疗EBV-相关疾病的可能性，其在不同pH水平的稳定性是重要的。L-I-OddU在37℃置于如所示的不同pH下3小时。化合物保持为L-I-OddU的百分数用HPLC以C18柱检验。
表4％保持L-I-OddU L-Br-OddUpH1 102 105pH2 102 --pH5 102 --pH7 99--pH9 100 --
此研究有力地说明，L-I-OddU和L-Br-OddU可以口服使用，因为其在pH2是稳定的，因此能够通过小肠上部(十二指肠，空肠，回肠)，在该处容易吸收而不被胃酸明显地失活。
(5)L-I-OddU和L-Br-OddU在小鼠体内的初步药物动力学研究L-Br-OddU和L-I-OddU的药物动力学在BDF1小鼠体内如前所述进行检验。我们通过如上更详细描述的，口服(po)，腹膜内(ip)，和静脉内(iv)给药50mg/kg进行初步药物动力学研究。对于L-Br-OddU，ip和iv组的多相浓度曲线是相似的，因此，为了简洁，只给出了ip曲线。在L-I-OddU的情况下，口服给药被显示。对于1997年11月13日的各个药物的血浆浓度由附图5和6表示。
从药物动力学可以概括出，L-Br-OddU和L-I-OddU可以采取口服给药，效率约60％，好于L-FMAU。
5-卤素取代的L-OddU衍生物的抗VZV活性Varicella-Zoster病毒(VZV)的蚀斑减少试验使用前2天，人包皮纤维细胞(HFF)被铺入六孔板内，并在37℃，带5％CO2，90％湿度下温育。在试验日期，药物被用2％FBS基于MEM制成，然后用六种药物浓度在MEM中系列稀释1∶5。初始浓度为100μg/ml最低0.03μg/ml。用于感染的病毒在含10％FBS的MEM中稀释至所需的浓度，每孔给出20-30斑。将培养基从孔中吸出，往每孔中加入0.2ml病毒三份，0.2ml培养基被加入药物毒性孔中。然后将板温育1小时，每15分钟摇动一次。温育后，含有各种药物浓度的MEM以2.0ml的体积被加入合适的孔中。第5天再加入另外的培养基，培养物总共温育10天。最后，将液体吸出，用6％中性红溶液染色6小时，洗涤，用立体显微镜数斑数。结果与未处理的对照比较，并计算EC50和CC50值。结果示于下表5中。
表5药物抗Varicella-Zoster病毒的效力和毒性药物aEC50bCC50L-Cl-OddU 27.9 ＞100L-Br-OddU 0.8 ＞100L-I-OddU4.2 ＞100ACV(acycloguanine) 0.6 ＞100
aVZV的Ellen菌株，在人包皮(HFF0细胞)上的蚀斑减少试验b未感染的HFF细胞，中性红摄取细胞毒性鉴定。
通过5-卤代的β-L-OddU类似物的VZV抑制，特别是，L-Br-OddU证明此化合物对于抗VZV感染是特别有效的化合物。
L-I-OddU的抗HV8活性DNA杂交，剂量应答实验往体腔B细胞-淋巴癌细胞(被HV-8感染)，每ml 5×105个细胞的种子密度，加入TPA(氟波醇酯)至浓度为20ng/ml。往此样品中加入DHPG(20μM或5μM)或L-IOddU(20μM，5μM，0.25μM，或0.125μM)。该样品在37℃温育48小时。然后收获细胞，并通过将1ml DNAzoltm试剂加入107细胞中，并通过轻轻吸液溶解细胞，提取DNA。然后通过加入0.5％乙醇(100％)沉淀溶胞产物中的DNA。样品通过倒置而混合并在室温下贮存3分钟。然后将DNA沉淀用1ml 95％乙醇洗涤两次。然后将DNA晾干5-15分钟，然后再悬浮于300μl 8mM氢氧化钠中。一旦DNA溶解，马上将溶液用44μl 0.1M HEPES中和。然后测量DNA浓度，将2.5μg各个样品的DNA用BAMHI限制酶在37℃消化1小时。各个样品消化过的DNA然后在1％琼脂胶上蔓生，然后转移到Hybond-N纸上过夜。DNA印迹与HV-8(HHV-8)探针杂交过夜。第二天，将印迹洗涤并暴露于x-射线胶片几天。然后将胶片显影，然后将磷酸图象仪用于测定各个带的密度。
上述实验的结果在附图7中给出。这些结果证明，L-IOddU在各种浓度下的DNA杂交抑制百分数明显地高于DHPG的DNA杂交，因而在这些细胞系中，L-IOddU显示出更高的抗HV-8活性。预计L-IOddU体内抗HV-8是有效的。应该注意到，DHPG在5μM浓度下不显示杂交抑制作用。
本专业技术人员应该懂得，前面的说明书和实施例是举例性地实施本发明，但不在任何意义上具有限制作用。本文出现的细节的改变可以在不偏离如下面权利要求书定义的本发明的精神和范围的情况下进行。
权利要求
1.如下结构的化合物
其中R是H，F，Cl，Br，I，CH3或CF3；和R1是H，C1至C20酰基或醚基，磷酸酯基，二磷酸酯基，三磷酸酯基或磷酸二酯基。
2.根据权利要求1的化合物，其中R是H，Br或I。
3.根据权利要求1的化合物，其中R是Br或I。
4.根据权利要求1的化合物，其中R是I。
5.根据权利要求1的化合物，其中R1是C1至C3酰基。
6.如下结构的化合物
其中R是Br或I而R1是H。
7.根据权利要求6的化合物，其中R是I。
8.一种用于治疗在患者体内的EBV，VZV或HV-8感染的药物组合物，包括治疗有效量的如下结构的化合物
其中R是H，F，Cl，Br，I，CH3或CF3；和R1是H，C1至C20酰基或醚基，磷酸酯基，二磷酸酯基，三磷酸酯基或磷酸二酯基，与药用添加剂，赋性剂或载体结合。
9.根据权利要求8的组合物，其中R是Br或I而R1是H。
10.根据权利要求9的组合物，其中R是I。
11.根据权利要求9的组合物，其中R1是C1至C3酰基。
12.一种药物组合物，包括治疗有效量的(2S，4S)-1-[(羟甲基)-1，3-二氧六环-4-基]-5-碘代尿嘧啶或(2S，4S)-1-[(羟甲基)-1，3-二氧六环-4-基]-5-溴代尿嘧啶与药用添加剂，赋性剂或载体结合。
13.一种治疗在患者体内由EB病毒，带状疱疹病毒和卡波西肉瘤病毒引起的病毒感染的方法，包括对所说的患者施用治疗有效量的如下结构的化合物
其中R是H，F，Cl，Br，I，CH3或CF3；和R1是H，C1至C20酰基或醚基，磷酸酯基，二磷酸酯基，三磷酸酯基或磷酸二酯基。
14.根据权利要求13的方法，其中R是H，Br或I。
15.根据权利要求13的方法，其中R是Br或I。
16.根据权利要求13的方法，其中所说的病毒感染是由EB病毒引起的，而R是I。
17.根据权利要求13的方法，其中R是C1至C3酰基。
18.根据权利要求13的方法，其中所说的病毒感染是由带状疱疹病毒引起的，而R是Br。
19.一种治疗在患者体内EB病毒感染，带状疱疹病毒感染或HV-8感染的组合物，包括如下结构的化合物
其中R是Br或I而R1是H。
20.根据权利要求17的化合物，其中R是I。
21.预防或延缓患者体内的EBV-相关的淋巴癌或癌症或卡波西肉瘤发病的方法，包括对处于患EBV-相关的淋巴瘤或癌症或卡波西肉瘤危险的患者施用治疗有效量的如下结构的化合物
其中R是H，F，Cl，Br，I，CH3或CF3；和R1是H，C1至C20酰基或醚基，磷酸酯基，二磷酸酯基，三磷酸酯基或磷酸二酯基。
22.根据权利要求21的方法，其中所说的患者是免疫缺损的患者。
23.根据权利要求21的方法，其中所说的患者是器官移植患者。
24.根据权利要求21的方法，其中所说的患者被输过血。
25.根据权利要求21的方法，其中R是I或Br。
全文摘要
本发明涉及这样一个发现,即某些含有尿嘧啶碱,优选地为5－卤素取代的尿嘧啶碱的β－L－二氧戊环核苷类似物出乎意料地显示出具有很高的抗EB病毒,带状疱疹病毒和人疱疹病毒8(HV－8)活性。具体地,本发明的化合物显示出很强的病毒复制(病毒生长)抑制作用,而对宿主细胞(即,动物或人体组织)只有很低的毒性。化合物可用于治疗人体的EBV,VZV和HV－8感染。
文档编号A61K31/506GK1244799SQ97181404
公开日2000年2月16日 申请日期1997年11月14日 优先权日1996年11月15日
发明者郑永齐, 朱重光, 曲福成 申请人:耶鲁大学, 佐治亚大学研究基金会