聚乙二醇化的oxm变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 公开了一种组合物，其包括经由可逆连接基团连接的胃泌酸调节素和聚乙二醇聚 合物（PEG聚合物），所述可逆连接基团例如9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲 氧羰基（FMS)。还公开了包含可逆聚乙二醇化胃泌酸调节素的药物组合物和其使用方法。
【背景技术】
[0002] 胃肠道负责合成和释放多种调控进食行为的肽激素，包括胰腺蛋白（PP)、胰高血 糖素样肽I (GLP-I)、肽YY(PYY)和胃泌酸调节素（OXM)。OXM由肠道和CNS中的胰高血糖素 原的组织特异性翻译后加工产生。它含有37个氨基酸，包括具有C末端碱性八肽延伸的完 整胰高血糖素序列，所述碱性八肽延伸被证明体外和体内都有助于OXM的性质，但对于肽 的作用而言，单独的所述碱性八肽延伸是不足够的。响应于食物摄入，OXM由肠道L细胞与 膳食热量含量成比例地分泌到血流中。
[0003] OXM在口服和腹膜内施用之后经由刺激胰岛素分泌而增强葡萄糖清除。它还调控 食物摄入的控制。将OXM脑室内（ICV)和核内注射到下丘脑的室旁核和弓状核（ARC)中抑 制了空腹大鼠的再摄食。此抑制在自由摄食的大鼠中在黑暗期开始时也已经得到证实。此 外，外周施用OXM剂量依赖性地抑制空腹诱导的和黑暗期的食物摄入。
[0004] 不利的药物动力学（例如短暂的血清半衰期）可以防碍多种在其它方面有前景的 候选药物的药学开发。血清半衰期是分子的经验特征，并且对于每种新的潜在药物必须以 实验方式测定。举例来说，对较低分子量的蛋白质药物，例如肾过滤的生理清除机制可以使 得维持药物的治疗水平因为所需给药方案的成本或频率而不可行。
[0005] 蛋白质，且尤其是短肽，在血液、肝脏或肾脏中易于变性或酶促降解。因此，蛋白质 通常具有几小时的短暂循环半衰期。由于其低稳定性，肽类药物通常以持续频率传递以便 维持活性肽的有效血浆浓度。此外，因为肽类药物通常通过输注来施用，频繁注射肽类药物 对对象引起相当大的不适。因此，需要可以延长治疗性蛋白质和肽的半衰期同时维持其高 药理学功效的技术。此类所要肽类药物应该还符合以下要求：血清稳定性增强、活性高并且 当注射到对象中时诱导不希望的免疫应答的概率低。
[0006] 本发明涉及OXM衍生物，其中利用可逆聚乙二醇化技术来延长肽的半衰期。
【发明内容】
[0007] 在一种实施方式中，本发明涉及一种组合物，其由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)组成，其中 所述PEG聚合物经由Fmoc或FMS与所述胃泌酸调节素的氨基末端连接。
[0008] 在一种实施方式中，本发明涉及一种组合物，其由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)组成，其中 所述PEG聚合物经由Fmoc或FMS与所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的十二号位置上的赖 氨酸残基（Lys 12)连接。
[0009] 在另一种实施方式中，本发明涉及一种组合物，其由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合 物（PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)组成， 其中所述PEG聚合物经由Fmoc或FMS与所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的三十号位置上 的赖氨酸残基（Lys3tl)连接。
[0010] 在一种实施方式中，本发明涉及一种改进胃泌酸调节素的曲线下面积（AUC)的方 法，其由以下步骤组成：使聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）经由9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或 2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)与所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的12号位置上的赖氨 酸残基或30号位置上的赖氨酸残基或氨基末端缀合。
[0011] 在另一种实施方式中，本发明涉及一种降低胃泌酸调节素的给药频率的方法，其 由以下步骤组成：使聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）经由9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺 基-9-芴基甲氧羰基（FMS)与所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的12号位置上的赖氨酸残 基或30号位置上的赖氨酸残基或氨基末端缀合。
[0012] 在另一种实施方式中，本发明涉及一种延长胃泌酸调节素的生物半衰期的方法， 其由以下步骤组成：使胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基 (Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)以1: 1:1的摩尔比缀合，其中所述PEG聚合物经 由9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)与所述胃泌酸调节素的氨 基酸序列的12号位置上的赖氨酸残基或30号位置上的赖氨酸残基或氨基末端缀合。
[0013] 通过以下详细描述实例和附图，本发明的其它特征和优势将是明显的。然而，应理 解，当指明本发明的优选实施方式时，所述详细描述和特定实例示仅以说明方式给出，因为 由此详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员将是明显的。
【附图说明】
[0014] 图1展示产生的PEG-FMS-0XM缀合物的不同变体。
[0015] 图2是展示非均质PEG3q-FMS-OXM和三种PEG3q-FMS-OXM变体（氨基、Lysl2和 Lys30)当与过表达GLP-I受体的CHO-Kl细胞一起温育时的体外活性（cAMP定量）的图。
[0016] 图3是展示非均质PEG3q-FMS-OXM和三种PEG3q-FMS-OXM变体（氨基、Lysl2和 Lys30)在IPGTT模型中的体内活性的图。与运载工具（vehicle)组相比，所有化合物都诱 导葡萄糖耐受性。
[0017] 图4展示非均质PEG30-FMS-0XM和三种PEG30-FMS-0XM变体（氨基、Lysl2和 Lys30)对于雄性ob/ob小鼠的体重的影响。
[0018] 图5展示非均质PEG30-FMS-0XM和三种PEG30-FMS-0XM变体（氨基、Lysl2和 Lys30)对于雄性ob/ob小鼠的食物摄入的影响。
[0019] 图6展示非均质PEG30-FMS-0XM和三种PEG30-FMS-0XM变体（氨基、Lysl2和 Lys30)对于雄性ob/ob小鼠的非空腹和空腹葡萄糖的影响。
[0020] 图7展示M0D-6031、OXM和利拉鲁肽（Iiraglutide)对于雄性ob/ob小鼠的累积 食物摄入的影响。
[0021] 图8展示M0D-6031、OXM和利拉鲁肽对于雄性ob/ob小鼠的体重的影响。
[0022] 图9展示M0D-6031、OXM和利拉鲁肽对于雄性ob/ob小鼠的自由摄食和空腹血浆 葡萄糖的影响。
[0023] 图10展示在研究第2天M0D-6031和配对喂养组对于雄性ob/ob小鼠的葡萄糖耐 受性（2g/kg po)的影响。
[0024] 图11展示在研究第30天M0D-6031和配对喂养组对于雄性ob/ob小鼠的葡萄糖 耐受性（2g/kg po)的影响。
[0025] 图12展示M0D-603U0XM和利拉鲁肽对于雄性ob/ob小鼠的最终血浆胆固醇的影 响。
[0026] 发明详述
[0027] 本文中提供一种长效胃泌酸调节素以及其生产和使用方法。在一个方面，本发明 提供一种组合物，其包含或其组成为双重GLP-I/胰高血糖素受体激动剂、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)。在另一 种实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含或其组成为胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物 (PEG聚合物）以及9-芴基甲氧羰基（Fmoc)或2-磺基-9-芴基甲氧羰基（FMS)。在另一 种实施方式中，所述PEG聚合物经由Fmoc或FMS与胃泌酸调节素的氨基酸序列的十二号位 置上的赖氨酸残基（Lys 12)连接。在一种实施方式中，长效胃泌酸调节素是一种组合物，其 包含或其组成为胃泌酸调节素和经由Fmoc或FMS与胃泌酸调节素的氨基酸序列的十二号 位置上的赖氨酸残基（Lys 12)连接的聚乙二醇聚合物（PEG聚合物）。
[0028] 在另一个方面，本文中提供一种延长肽的血清半衰期的新方法。此方法基于聚乙 二醇（PEG)链与所述肽通过化学接头（称为FMS或Fmoc)的可逆连接，使得原生肽缓慢释 放到血流中。然后，所释放的肽还可以穿过血脑屏障以进入中枢神经系统（CNS)或任何其 它靶器官。在一种实施方式中，FMS接头的独特化学结构产生特定肽释放速率。
[0029] 因此，在另一种实施方式中，本文中提供一种延长OXM肽的生物学半衰期的方法。 在另一种实施方式中，本文中提供一种延长OXM在生物学液体中的循环时间的方法，其中 通过缓慢释放完整OXM肽来延长所述循环时间。在另一种实施方式中，延长所述OXM肽的 所述生物学半衰期或所述循环时间使得所述OXM可穿过血脑屏障并且靶向CNS。本领域技 术人员应充分了解，所述生物学液体可以是血液、血清、脑脊液（CSF)等。
[0030] 在一种实施方式中，在将本发明的聚乙二醇化胃泌酸调节素组合物施用到对象中 后，作为所述FMS或所述Fmoc接头从所述组合物化学水解的结果，胃泌酸调节素释放到对 象的生物学液体中。在另一种实施方式中，所释放的胃泌酸调节素是完整的并且重新获得 完全的GLP-I和胰高血糖素受体结合活性。在另一种实施方式中，使所述FMS或所述Fmoc 化学