该申请主要旨在借助于药物化合物靶向含OTU的病毒蛋白质的去 ISG化活性。然而，这个申请没有公开或甚至没有暗示动脉炎病毒中的修饰，其特异性去除 DUB/去ISG化活性，同时保持多蛋白加工功能完整。
[0022] 因此，基本上引起DUB/去ISG化活性的显著减少的已知突变看起来不可避免地导 致无法接受的病毒复制减少或在大多数情况下导致完全没有病毒复制。
[0023] 迄今为止可接受结果的缺乏强烈表明可能完全无法解开PLP2的多蛋白加工功能 和DUB/去ISG化活性之间的密切联系。
[0024] 本发明的目的是提供动脉炎病毒科的病毒，其一方面仍是可复制，并且然而，另一 方面展示减少的PLP2的DUB/去ISG化活性。
[0025] 现惊讶地发现尽管用于多蛋白加工功能和DUB/去ISG化活性的PLP2活性位点是 相同的，但一方面对于Ub和ISG15的底物结合是不同的，并且另一方面nsp2/nsp3切割位 点是不同的。
[0026] -方面结合Ub的|3 -抓握折叠（beta-grasp fold)或ISG15的C末端|3 -抓握折 叠的PLP2结构域的部分，并且另一方面参与结合多蛋白的非结构区（其含有xxGG基序，其 类似于Ub或ISG15的C末端尾部的非结构区）的区域的这种鉴定，现在首次可以通过nsp2 的PLP2结构域（更具体而言当与泛素结合时）的3D结构的阐明和分析而完成。
[0027] 迄今为止，尤其是由于生长适合于X射线晶体学的蛋白质晶体中的困难，不能测 定PLP2结构域的3D结构。
[0028] 待解决的第一个问题涉及产生允许进行PLP2结构域的结晶分析的足够量的nsp2 片段。Nsp2在表达系统中弱表达，并且当作为融合蛋白表达时，难以在PLP2没有变得不可 溶且因此不适合于蛋白质结晶的情况下，与融合配偶体拆分。
[0029] 目前惊讶地发现与来自表达质粒pASK3 (Gohara D等人，（1999))的N末端泛素一 起在框内表达EAV PLP2结构域（在这种情况下为多蛋白的残基261-392,但不一定如此）， 足以获得这样的蛋白质，其1)具有天然N末端，如在蛋白质源于病毒多蛋白时的情况那样， 和2)可以以足够数量产生用于结晶目的。通常，质粒pASK3用于在大肠杆菌（万.cWi)细 胞中表达蛋白质，所述大肠杆菌细胞还表达DUB泛素蛋白酶I (Ubpl)，因此，N末端泛素标 签在表达后不久被切割掉。然而，在本发明的情况下，由于PLP2自身充当DUB的事实，使用 不同时表达DUB Ubpl的质粒pASK3,足以表达与N末端泛素标签一起在框内的多蛋白残基 261-392 (即EAV nsp2的PLP2结构域）。此外，由于PLP2正好在其识别位点LxGG后进行 切割的事实，如在该蛋白质源于病毒复制酶多蛋白切割时的情况下那样，产生了具有其天 然N末端的PLP2片段。EAV nsp2的PLP2结构域和使用表达质粒pASK3的这种特异性组合 提供了蛋白质片段，其事实上具有天然N末端，并且以足够数量产生以允许通过蛋白质X射 线晶体学测定PLP2结构域的三维结构。
[0030] 在测定PLP2结构域的3D结构过程中遇到的第二个问题是不能使纯化的PLP2结 构域结晶。为了克服这个问题，在下一步中，如由James等人（2011)描述的，根据Messick 等人（2008)和Borodovsky等人（2002)，制备基于机制的自杀性抑制剂Ub (1_ 75)-3_溴丙胺 (Ub-3Br)。随后，通过将蛋白质分别以3:2摩尔比在37°C下轻轻混合一小时，使Ub-Br3与纯 化的PLP2共价结合。所得到的PLP2-泛素复合物通过凝胶过滤、阴离子交换（Source 15Q) 层析进行纯化，并且随后交换到20 mM Tris、pH 8. 0、50 mM NaCl内，之后浓缩至10 mg/ml 且贮存于4°C。
[0031] 通过PLP2结构域的催化亲核体（Cys 270)和泛素的C末端之间的共价键得到稳 定的这种PLP2-泛素复合物的形成，获得足够稳定以进行结晶且允许通过X射线结晶学测 定复合物的3D结构的复合物。PLP2-Ub复合物通过悬滴蒸汽扩散进行结晶。
[0032] 实施例部分提供了关于结晶过程的进一步详细信息。
[0033] 如上所述，测定作为与基于机制的抑制剂Ub_Br3的共价复合物的EAV PLP2结构 域（EAV ppla的残基261-392 ;13. 6 kDa)的晶体结构。因为多个半胱氨酸残基的保守性 及其对于蛋白酶功能性的经证实的重要性表明了 PLP2可以结合锌（Snijder等人，1995)， 所以通过多波长反常色散（MD)定相实验，使用经过锌吸收边缘收集的X射线衍射数据， 测定复合物的晶体结构。所得到的电子密度图揭示与完整泛素分子结合的PLP2的残基 261-387,且允许构建复合物模型且完善〇?工作=0? 16, ％离=0? 18)至L 45 A分辨率（图 1A) 〇
[0034] PLP2采取具有浅Ub结合位点的紧密的二结构域折叠，其将结合的Ub分子（Ub二 聚体的'远侧'Ub)的C末端导向暴露于溶剂的活性位点（图1A)。PLP2的结构域I (残基 267-307和365-378)由正对着双链反向平行片层（(62丨(66丨）包装的三螺旋束（a 1、 a 2、a 4)组成。结构域II集中于四链0-片层（M t 05 I 04 f 03个）和a-螺 旋（a 3)，其正对着结构域I的螺旋a 1和a 2 -起包装。结构域II包含Ub结合位点的大 部分，其通过四个半胱氨酸残基（Cys 319、349、354、356)稳定，所述残基以四面体几何形 状与锌离子配位（图1B)。它们的排列形成C4锌指，其类似C末端型锌项链基序（Andreini 等人，2011)(图1B)。在位置Cl (Cys319)和C2 (Cys349)之间的大插入物看起来将锌 指的稳定效应延伸通过结构域II的大部分。第五个半胱氨酸（Cys344)定位接近锌离子，但 不与之配位，与已描述的其他锌项链基序一致（Andreini等人，2011)，且与显示Cys344至 丙氨酸的突变对PLP2结构域的催化活性没有影响的先前发现一致（Snijder等人，1995)。 所述半胱氨酸中的三个（Cys 319、349和354)在动脉炎病毒中是完全保守的，并且这些残 基和Cys356的突变分析证实它们的存在对于催化活性是必需的（Snijder等人，1995)。 然而，考虑到其与活性位点的距离（~25A)(图1A)，与参与催化相反，锌指看起来发挥结构 作用。在不存在锌的情况下（M9培养基）生长的大肠杆菌中表达PLP2结构域获得不溶性 蛋白质，支持锌指是结构性的且可能是蛋白酶的正确折叠所需的观点。
[0035] PLP2活性位点含有催化性半胱氨酸亲核体（Cys270)和组氨酸（His332)残基， 连同与His332的咪唑环氢键合的伴随天冬酰胺（Asn263)(图1C)。Cys270的侧链经由 3_丙胺（3CN)修饰与Ub的C末端共价偶联，模拟催化反应的酰基酶中间体步骤，并且证实 Cys270作为催化亲核体的特性（图1A，C)。
[0036] 动脉炎病毒PLP2衍生自典型的OTU结构域结构。OTU超家族的成员分类为动脉 炎病毒PLP2的结构相关物，支持其作为该超家族成员的分类。然而，在动脉炎病毒PLP2和 OTU结构域蛋白酶之间的序列相似性非常弱（Makarova等人，2000)，并且事实上EAV PLP2 结构显示出相当大地偏离典型OTU-折叠的拓扑特点。已知OTU结构域结构的结构域I含有 一对暴露于溶剂的a螺旋，其正对着两个内部螺旋垂直包装（图1D，G，H)。虽然内部螺旋 在PLP2中是保守的（a 1和a 2)，但暴露于溶剂的螺旋被替换为单个螺旋（a 4)，其与螺旋 a 1和a 2平行包装，从而形成上文描述的三螺旋束（图1A，F)。这种拓扑学精细地类似于 木瓜蛋白酶的L结构域（Kamphuis等人，1984)，并且显著降低PLP2的结构域I的大小及 其相对于其他OTU结构域DUB对Ub结合的贡献，所述其他OTU结构域DUB已在具有Ub的复 合物中进行测定（Akutsu 等人，2011 ;Capodagli 等人，2011 ;Huang 等人，2012 ;James 等人，2011 ;Messick 等人，2008)。
[0037] 与已知OTU结构域结构的更惊人偏离是PLP2的结构域II中锌指的存在（图1A， B)及其对于催化活性的关键重要性（Snijder等人，1995)。含锌指的Ub结合结构域存 在于许多OTU结构域DUB中，但无一包含在OTU结构域折叠内的远侧Ub结合位点的一部 分。它们相反作为通过弹性接头与OTU结构域连接的附属结构域存在（Komander等人， 2009)，其中在A20的情况下，它们看起来提供另外的聚泛素连接特异性且可能将蛋白质靶 向特异性信号转导复合物（Bosanac等人，2010)。对于PLP2,锌指基序是OTU折叠的整合 部分，并且如下所述，在结合远侧Ub分子且将远侧Ub分子定位在蛋白酶表面上起关键作用 (图1)。目前OTU结构域DUB基于其结构特征分组成三个亚类：0tubain、A20样OTU和OTU (Komander 等人，2〇〇9) 〇
[0038] 考虑到EAV PLP2的令人惊讶的独特特点，本发明人现在认为动脉炎病毒PLP2酶 代表锌依赖性OTU的新（第四个）亚类。
[0039] 动脉炎病毒PLP2和CCHFV OTU与真核OTU结构域DUB相比的独特之处在于它们 除了 Ub之外还从细胞靶中去除ISG15。
[0040] 对于CCHFV OTU观察到的对带ISG15标签的底物的交叉反应性主要起于在Ub结 合位点上的独特0 -发夹，其修饰该位点，从而使得它可以容纳Ub和ISG15的C末端Ub样 结构域两者（Akutsu等人，2011 ;James等人，2011)。
[0041] 目前惊讶地发现尽管动脉炎病毒