动脉炎病毒的制作方法
【专利说明】动脉炎病毒
[0001] 本发明涉及可复制的动脉炎病毒，其作为药物的用途，其作为疫苗和在预防中的 用途，包含此类动脉炎病毒的疫苗和动脉炎病毒PLP2-泛素复合物。
[0002] 动脉炎病毒（Arteririrw1S)科属于巢状病毒（Ai'oWira/es)目，其中目前已知四 个物种：马动脉炎病毒（你arteri(is rirys)、猪繁殖与呼吸综合征病毒 respiratoryandreproductivesyndromevirus)(PRRSV)、乳酸脱氢酶增高病毒 {,Lactatedehydrogenaseelevatingvirus)(UW) #口I矣出AefflorrAagic rirM) (SHFV)。LDV和SHFV仅具有较小的经济影响，因为它们分别感染小鼠和猴。 与之相反，EAV且尤其是PRRSV对社会造成相当大的财政负担。
[0003] 马动脉炎病毒在马中引起感染，并且因此在马养殖业中形成重复发生的问题。因 此，它对马饲养者造成重大的经济负担。马动脉炎病毒在所谓的"携带公马"中建立持续性 感染，所述携带公马随后将病毒传播给母马，潜在导致胎儿流产。
[0004] 马饲养者小心地监控尤其是公马中的EAV的存在，并且已基于活减毒病毒或基于 EAV结构亚单位表达开发了针对该病毒的许多疫苗。然而，近期在美国新墨西哥州（2006) 和法国（2007)的暴发已提高了兽医和马业主对EAV的兴趣。并且尽管诊断工具和疫苗是 可获得的，但目前可用的疫苗应进行改良（见下文）。
[0005] PRRSV是迄今为止经济上最重要的动脉炎病毒，影响全世界的猪养殖产业。被 这种病毒感染导致断奶至肥育猪的缓慢生长、降低的饲料效率、厌食和发热，怀孕母猪的 流产和幼猪的呼吸问题。单在美国，与PRRSV感染相关的每年损失在2005年估计约为$ 560, 000, 000和在2011年为$ 664, 000, 000。PRRSV感染为养猪业中排名第一的健康挑战， 当与由例如难辨梭菌猪流感、链球菌属物种 sp.)、轮状病毒或猪圆环病毒引起的其他疾病相比较时，引起最大的生产力损失。考虑2006 年在东南亚出现的PRRSV高度强毒株和亚洲养猪业是全世界最大的事实，可以肯定地认为 在世界的这个部分中的损失明显高于对于美国报告的那些。
[0006] PRRSV仍是养猪业的主要威胁，因为尽管可得到针对PRRSV的活减毒和灭活疫苗 两者，但已证明相关疾病仍是难以控制的。
[0007] 活减毒疫苗通常包含通过毒株在细胞培养中的连续传代产生的病毒，导致在猪中 不再诱导疾病的减毒病毒。这些疫苗一般诱导一定水平的长效保护。然而，当衍生自单一 PRRSV疫苗株时，它们可能无法完全保护不受异源PRRSV感染（PRRSV分离物可以是高度差 异的且分组成欧洲和北美基因型）。另外，用活减毒疫苗的疫苗接种可能无法完全预防野 生型病毒的再感染，并且在几个场合下观察到疫苗病毒通过接种疫苗兽群的传播。另外，已 观察到疫苗株的毒力的逆转。（Storgaard, T.等人，（1999)，Botner, A.等人，（1997)， Nielsen, H. S.等人，（2001))。
[0008] 此外，因为目前不存在商购可得的标记疫苗，所以不可能区分接种疫苗和天然感 染的动物。
[0009] 灭活病毒的疫苗也是可获得的，并且它们在本质上安全得多，因为它们不涉及复 制的病毒。然而，另一方面，病毒复制的缺乏可能是这些疫苗一般功效较低的主要原因。
[0010] 在有效的动脉炎病毒疫苗开发中的另外的复杂化因素主要在于动脉炎病毒被认 为逃避宿主的先天性免疫应答的事实。一般而言，认为动脉炎病毒的强免疫调节能力阻止 (活减毒）疫苗诱导有效的免疫应答。因此，可以诱导的免疫水平对于保护预防攻击病毒可 能不是最理想的。
[0011] 因此，需要减小或甚至解决与经典的基于灭活的和活减毒的动脉炎病毒的疫苗相 关的问题的替代方案。
[0012] 动脉炎病毒科由基因组大小范围为约13-16 kb的正义（+)单链RNA病毒组成。在 感染后，RNA翻译成两种复制酶前体多蛋白，ppla和pplab。通过内部编码的蛋白酶对这些 多蛋白的切割，衍生出动脉炎病毒的功能性非结构蛋白（nsps)。在从多蛋白中释放后，这些 非结构蛋白一起形成复制和转录复合物，其负责病毒基因组的复制和编码结构蛋白的亚基 因组信使RNA的合成。原型动脉炎病毒EAV的ppla和pplab多蛋白通过存在于非结构蛋 白I (nspl)、nsp2和nsp4中的三种内部蛋白酶切割成至少13种非结构蛋白。
[0013] 动脉炎病毒nsp2在其N末端区域中含有木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLP)结构域。如 该蛋白酶通常被提及的，PLP2负责切割nsp2和nsp3之间的连接，并且可能是由于这个原 因，它的催化活性是病毒复制必需的。（较早的文献通常将该蛋白酶称为CP (半胱氨酸蛋 白酶）或nsp2 CP)。
[0014] 除了其在多蛋白加工中的作用之外，最近发现nsp2还在如上所述的宿主先天性 免疫应答的逃避中起作用。在感染后，病毒核酸的存在可以触发先天性免疫信号转导级联 的活化，导致转录因子例如NF K B和Irf3/Irf7的活化，最终导致编码0干扰素（IFN- 0 ) 及其他促炎细胞因子的基因的转录。除通过蛋白质磷酸化之外，这些信号转导途径还通过 蛋白质泛素化而受到正面和负面的广泛调节（Jiang，X. (2012))。当比较序列分析显示 该蛋白质的PLP2结构域显示出与属于含卵巢肿瘤结构域（OTU)类的去泛素化酶（DUB)的 蛋白质非常遥远的相似性时，人们对nsp2的可能的免疫逃避活性的兴趣提高了（Makarova (2000))。此后，已证实动脉炎病毒PLP2确实具有真正的DUB活性，并且该活性或许可用 于从先天性免疫信号转导因子中除去泛素（进一步也称为Ub)，以抑制或降低抗病毒状态 的诱导（Frias-Staheli，N. (2007)，Sun, Z. (2010)，van Kasteren，P.B. (2012))〇 除了其DUB活性之外，动脉炎病毒PLP2还已显示从细胞靶蛋白去除泛素样抗病毒蛋白： 干扰素刺激基因 15 (ISG15) (Frias-Staheli, N. (2007)，Sun, Z. (2012)，Arguello, M.D. (2007))。这种活性被称为去ISG化（deISGylating)活性。由于泛素和ISG15紧密关 联性，PLP2结构域的这种作用一般被称为DUB/去ISG化活性。
[0015] 在多蛋白加工功能和DUB/去ISG化活性之间显然存在非常紧密的联系，因为两种 活性均依赖PLP2中的相同催化核心氨基酸残基。此外，限定动脉炎病毒复制酶多蛋白内的 nsp2/nsp3切割位点的序列（xxGG)展示了与见于泛素和泛素样分子ISG15中的典型C末端 基序（LRGG)的相似性，其中切割在紧邻第二个甘氨酸残基后发生。因此，这个紧密联系使 得非常难以（如果不是不可能）独立地研宄这些底物特异性。
[0016] 已描述了在PLP2结构域中或在PLP2结构域附近进行修饰的几个初步尝试，其特 异性降低或去除DUB/去ISG化活性，同时保持在nsp2/nsp3连接处的多蛋白加工功能完整 (如果没有这个，病毒就无法存活）。
[0017] Sun等人（2010)描述在PRRSV的PLP2结构域的N末端边界处的几个氨基酸位置 处制备突变的尝试。他们根据该区域中B细胞表位（ES2)的存在，选择了 PLP2结构域的某 一部分用于引入突变。如预期的，由于该区域在nsp2/nsp3连接处的多蛋白加工活性中的 重要性，迄今为止生成的PLP2突变中的大多数对病毒是致命的。仅在位置D458A、S462A和 D465A (编号参考Sun等人，2010)处的三个突变是"耐受的"，不引起病毒活力的完全丧失。 然而，这些突变型显示几乎没有任何减少或完全没有减少的NF K B活化抑制。
[0018] 仅可以得出结论在这些位置处制备的突变或者对病毒是致命的，或者产生在其通 过去泛素化抑制NF K B活化的能力方面与野生型病毒难以区分的活病毒。该研宄证实在多 蛋白加工和DUB/去ISG化中密切联系的PLP2功能是难以分开的。
[0019] Sun等人之后（Sun 2012)在研宄阻断DUB/去ISG化活性，同时维持PLP2多蛋白 加工功能的可能性的新尝试中，选择另一个区域用于引入突变。在Sun (2012)中，描述了 在PRRSV的PLP2结构域的N末端边界处的一组新缺失。发现只有跨越ORFla编码蛋白质 的氨基酸402-420的区域的缺失获得的病毒显示ISG15拮抗功能的部分减少，并且仍能够 复制，尽管滴度极低，条件是在位置462处存在另外的下游点突变。因此，该病毒出于提及 的原因而不适合作为活疫苗病毒的基础。
[0020] 专利申请W02012/063212描述制备可能导致PRRSV中的免疫逃避能力受损的修饰 的尝试。在该专利申请中，描述了突变型病毒，其包含位置分散遍及整个病毒基因组的32 个氨基酸变化，全部都在PLP2结构域之外，所有这些被认为直接负责病毒的干扰素诱导/ 抑制表型。因此，必须引入所有这些变化，以便将野生型病毒转变成具有降低的干扰素抑制 活性的可复制病毒。因为完全不存在哪一个/多个氨基酸变化实际上负责该抑制效应的指 示，所以无法作出关于该病毒的安全性的预测：单个点突变导致对毒力的逆转是完全可能 的，这可以使得该病毒成为不良的疫苗候选物。此外，关于哪些氨基酸负责减毒表型的知识 的缺乏使得难以由其他毒株构建新疫苗候选物：除了在病毒中引入32个氨基酸变化的艰 巨任务之外，这32种氨基酸突变在另一种病毒的不同序列背景下对病毒减毒和降低IFN抑 制具有相同作用是不太可能的。
[0021] 专利申请W02009/008924描述了通过抑制含OTU的病毒蛋白质的去ISG化活性来 预防病毒感染的方法。