和 Cys528 发挥，并且对于 EAV 毒株 Bucyrus，该作用由 Thr312、Ile313 和 ne353发挥。
[0069] 在本发明的第一个实施方案的优选形式中，由于nsp2的PLP2结构域中的突变而 具有减少的DUB/去ISG化活性的可复制的动脉炎病毒选自EAV和PRRSV。
[0070] 图3表示结构上比对的序列，其限定了代表主要EAV和PRRSV毒株的4种动脉 炎病毒序列的泛素相互作用表面比对。根据如图4中并排显示的晶体结构（EAV)或模型 (PRRSV)，在框指示在所有情况下均与泛素相互作用的PLP2氨基酸序列的每一个的区域的 意义上，所述比对实际上是结构的（比对）。
[0071] 由图3和4C可见，就其在与泛素的相互作用表面中的位置而言，一种动脉炎病毒 中的哪些氨基酸对应于另一种动脉炎病毒的哪些氨基酸，例如EAV中的1313 = LV中的 V479 和 VR2332 中的 L487。
[0072] 为了获得由于非结构蛋白nsp2的PLP2结构域中的突变而具有减少的DUB/去ISG 化活性的可复制的动脉炎病毒，可考虑图3优选在结构比对的PLP2序列中用粗线加框的区 域中和/或附近进行突变。
[0073] 图3中的氨基酸编号在此处代表动脉炎病毒的四个实例：对于EAV的毒株 Bucyrus以及对于PRRSV的Lelystad、VR-2332和GM2。显然，其他动脉炎病毒PLP2序列同 样可以与图3中已给出的序列进行结构上比对。如上所述，为便于参考，使用如图3中给出 的EAV的PLP2结构域的氨基酸序列编号，以指示各个加框区域。
[0074] 因此，这个实施方案的更优选形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎病毒，其特 征在于根据如图3中所述的EAV编号，PLP2结构域中的所述突变位于共有位置296-297和/ 或309-319和/或326-330和/或345-355中的任一处。在该图中，对于PRRSV Lelystad， 所述位置分别是 463-464、475-485、492-496 和 512-522。对于 PRRSV VR-2332 和 PRRSV GM2， 所述位置是 471-472、483-493、500-504 和 520-530。
[0075] 这个实施方案的甚至更优选的形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎病毒，其特 征在于根据如图3中所述的EAV编号，PLP2结构域中的所述突变位于共有位置296-297和 /或310-318和/或327-329和/或346-354中的任一处。
[0076] 仅作为实例，对于例如 PRRSV Lelystad，这些位置是 463-464、476-484、493_495 和 513-521。
[0077] 这个实施方案的仍甚至更优选的形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎病毒，其 特征在于根据如图3中所述的EAV编号，PLP2结构域中的所述突变位于共有位置296-297 和/或311-317和/或328和/或347-348和/或351-353中的任一处。
[0078] 本发明人例如通过定点诱变证实，例如EAV PLP2泛素相互作用表面的位置 Thr312、Ile313和Ile353对于酶的DUB活性和EAV病毒抑制IFN应答的能力是重要的。 PRRSV 毒株 Lelystad (Thr478、Val479 和 Val520)和 VR2332 (Ala486、Leu487 和 Cys528) 中的类似位置和鉴定为对于DUB和去ISG化活性重要的区域内的邻近氨基酸也可以突变， 以在PRRSV中实现相同的效应。考虑到EAV PLP2结构域的位置Ile313 (Lelystad PLP2 的 Val479、VR2332 PLP2 的 Leu487)和 Ile353 (Lelystad PLP2 的 Val520、VR2332 PLP2 的 Cys528)在泛素相互作用表面的暴露于溶剂的表面上，Lelystad或VR2332 PLP2结构域上 的这些位置可以突变为多种氨基酸，以选择性破坏DUB和去ISG化活性。此类氨基酸例如包 括八1 &、4找、561'、1111'、1'印（对此，本发明人已证实在￡4￥?1^2结构域中的位置353处，这 可以是耐受的）。EAV PLP2 的 Thr312 (Lelystad PLP2 的 Thr478、VR2332 PLP2 的 Ala486) 的侧链包装在紧密环内，因此在该位置处的突变需要更保守，因为它们可以使环错折叠。在 该位置处的可能突变包括例如Gly (对于EAV、Lelystad和VR2332)、Ala或Ser (EAV和 Lelystad)〇
[0079] 这个实施方案的最优选形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎病毒，其特征在于 PLP2结构域中的所述突变在共有位置T312、1313或1353处。
[0080] 这种最优选形式的具体形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎病毒，其特征在 于所述动脉炎病毒是EAV，并且PLP2结构域中的所述突变是T312A、I313V、I353A、I353R、 I353S、I353T 或 I353W。
[0081] 除了与泛素直接结合的PLP2结构域的泛素相互作用表面的残基（由图3中的粗 线加框）之外，存在结构上支持泛素相互作用表面且帮助限定这个表面的形状的许多残 基，从而使得它与泛素（和ISG15)的结构互补。基于EAV PLP2结构域的3D晶体结构以 及来自PRRSV毒株Lelystad和VR-2332的PLP2结构域的比较分子模型，EAV PLP2的残基 303-306 (Lelystad PLP2 的 470-473 和 VR-2332 PLP2 的 478-481)在将螺旋 2 置于 PLP2 酶的泛素相互作用表面之下起重要作用。在该区域内的残基突变可以用于影响螺旋2的正 确放置，导致泛素相互作用表面的变形和因此降低的DUB/去ISG化活性。考虑到这些残基 远离PLP2活性位点，它们的突变可以用于降低DUB/去ISG化活性，而对病毒多蛋白加工具 有最低限度的影响。
[0082] 因此，这个实施方案的另一种更优选形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎病 毒，其特征在于根据如图3中所述的EAV编号，PLP2结构域中的所述突变位于共有位置 303-306的任一处。在该图中，对于PRRSV Lelystad，所述位置是470-473。对于PRRSV VR-2332，所述位置是 478-481。
[0083]类似地，EAV PLP2 的残基 343-346 (Lelystad PLP2 的 510-513 和 VR-2332 PLP2 的518-521)帮助定位锌指基序的螺旋3,这是形成与Ub的许多关键结合相互作用的结构。 可以在该区域内产生残基的突变，以使锌指基序的位置和周围泛素相互作用表面变形，以 选择性降低DUB/去ISG化活性，而不影响病毒多蛋白加工。
[0084] 因此，这个实施方案的再另一种更优选形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎 病毒，其特征在于根据如图3中所述的EAV编号，PLP2结构域中的所述突变位于共有位置 343-346的任一处。在该图中，对于PRRSV Lelystad，所述位置是510-513。对于PRRSV VR-2332，所述位置是 518-521。
[0085]此外，EAV PLP2 残基 Phe350 (Lelystad PLP2 的 Val517 和 VR-2332 PLP2 的 Val525)位于锌指的螺旋3上，并且参与螺旋3正对着a-螺旋2的包装。考虑到螺旋3在 结合泛素中的重要性，EAV PLP2 残基 Phe350 (Lelystad PLP2 的 Val517 和 VR-2332 PLP2 的Val525)的突变可以用于转移螺旋3,从而选择性降低DUB/去ISG化活性。
[0086] 因此，这个实施方案的仍另一种更优选形式涉及根据本发明的可复制的动脉炎病 毒，其特征在于根据如图3中所述的EAV编号，PLP2结构域中的所述突变位于共有位置350 处。在该图中，对于PRRSV Lelystad，所述位置是517。对于PRRSV VR-2332,所述位置是 525。
[0087] 可以引入到被视为对于DUB和去ISG化活性是重要的PLP2酶的区域内的残基突 变类型取决于待突变的一个或多个残基的局部环境，并且可以由技术人员测定而没有过度 负担。例如，如果残基在泛素相互作用表面的表面上，并且具有正对着泛素的疏水区包装的 疏水侧链（例如亮氨酸），允许的突变可以包括：1)侧链的完全去除（即由甘氨酸取代）， 2)由极性侧链取代以通过静电的方式破坏疏水性相互作用（例如Asp、Glu、Ser等），3)由 大的大体积残基取代以在空间上破坏所述相互作用（例如Trp、Arg、Lys)。注：Arg和Lys 具有极性和大体积二者，这可以提供协同效应，导致在该位置处的相互作用的相当大破坏。 跨越泛素相互作用表面的此类突变组合可以用于实现DUB和去ISG化活性的最大限度降 低。
[0088] 如果靶向的残基是埋入的疏水残基，则取代需要是更保守的，即取代应优选是另 一个疏水残基，以保留总体适当的蛋白质折叠，但具有改变的形状，以便使泛素相互作用表 面变形，以降低DUB和去ISG化活性。
[0089] 如果靶向的残基形成蛋白质稳定性所需的重要静电相互作用，则只有保留这种相 互作用的那些取代才能引入在该位置处。
[0090] 可以就已在EAV PLP2酶中进行的取代（表1)观察上述诱变准则的实例。例如， Thr312的侧链包装在紧密环内，而在位置312处的另外体积可能使环的形状变形，可能引 起蛋白质错折叠。事实上，虽然T312A是耐受的，但T312L和T312V对病毒是致命的。T312L 引入体积更大的侧链，这可能破坏环结构且因此对病毒是致命的，而T312V去除看起来对 于病毒活力也是必需的极性羟基。相比之下，Ile353的侧链完全暴露于泛素相互作用表面