PLP2也显示出对带ISG标签的底物的交叉反应 性，但e-发夹结构在PLP2中完全不存在，并且替换为锌指基序的螺旋a 3。有趣的是，与 0 _发卡对CCHFV OTU的作用相一致，螺旋a 3的残基与Ub的疏水性' Ile44贴片'结合，所 述Ile44贴片是通常由Ub结合蛋白靶向的位点（Dikic等人，2009)，并且以与对于CCHFV OTU观察到的那种等价的方式帮助Ub与PLP2结构域的结合（图1E)。这种结合模型允许 CCHFV OTU容纳ISG15上的另外大体积残基，这些残基不存在于Ub上，这个特征看起来同样 存在于EAV PLP2中。
[0042] 如上所述，除了其靶向Ub和ISG15的异肽酶活性之外，动脉炎病毒PLP2还切割在 病毒多蛋白内的特异性肽键，作为复制酶多蛋白的成熟过程的一部分。考虑到螺旋a 3与 PLP2活性位点的距离（图1A)，目前首次可以确定突变可以引入Ub结合位点的这个区域 内，其将选择性破坏PLP2的DUB和去ISG化活性，而不影响该酶结合且切割病毒多肽内的 线性nsp2/nsp3连接的能力。这个发现通过下述观察得到巩固：尽管EAV的推定的nsp2/ nsp3切割位点（828-RLIGG丨-832)紧密类似于Ub和ISG15的C末端尾部（RLRGG丨），但 切割位点上游的nsp2序列看起来不具有Ub样折叠，指示PLP2 Ub结合位点的大部分不是 该酶识别且切割nsp2/nsp3连接所需的。
[0043] 本发明的优点之一是现在阐明了动脉炎病毒的PLP2结构域的3D结构，并且更重 要的是：在1.45 A的分辨率下。因此，现在首次能够执行PLP2去泛素酶和多蛋白切割活 性的结构指导的解耦；现在首次可以合理地决定任何动脉炎病毒中的PLP2结构域的哪些 区域能够或不能进行修饰，以便提供根据本发明的动脉炎病毒，即仍可复制但具有减少的 DUB/去ISG化活性的动脉炎病毒。
[0044] 仅作为例子，关于动脉炎病毒EAV，更具体而言关于毒株Bucyrus (GeneBank登录 号NC_0022532)，PLP2、泛素和PLP2-泛素结合表面的3D结构在图2中给出。
[0045] 然而，本文强调下述：本文提供以便获得PLP2-泛素复合物的晶体结构的新近开 发的表达方法和结晶方法的组合一般可应用于任何动脉炎病毒的PLP2结构域。
[0046] 同样重要的是认识到在这方面，主要是PLP2结构域的3D结构，而不仅是该结构域 的氨基酸序列决定泛素结合表面。这是从图3中给出的多重序列比对直接得出的。这种 结构功能比对包括EAV Bucyrus毒株以及三个代表性但不同的PRRSV毒株的PLP2序列： GM2 (中国野生株）、Lelystad (原型欧洲株）和VR-2332 (原型北美株）。立刻可以看出 在多种动脉炎病毒序列之间存在显著数目的差异，就个别氨基酸的特征而言且就多种毒株 的氨基酸数目中的差异而言都有差异，导致在比对中的几个位置处存在的缺口。然而，EAV Bucyrus毒株的PLP2结构域的泛素结合表面的3D结构和通过PRRSV毒株GM2、Lelystad和 VR-2332的比较分子建模预测的那些是惊人地相似的。这在图4中图解说明，其中显示了 EAV毒株Bucyrus、PRRSV毒株Lelystad和PRRSV毒株VR-2332的PLP2-泛素的结构模型。 再次，立即可以看出尽管在氨基酸序列和数目中存在差异，EAV和两种PRRSV毒株的PLP2结 构域的泛素结合表面是惊人地相似的。
[0047] 并且事实上这与预期一致：所有动脉炎病毒PLP2结构域均采取相同的催化核心， 且由于这种蛋白酶非常复杂的底物特异性，3D结构在动脉炎病毒科的多个成员中必须是非 常保守的。
[0048] 因此，本发明的第一个实施方案涉及可复制的动脉炎病毒，其特征在于由于非结 构蛋白nsp2的PLP2结构域中的突变，所述病毒具有减少的DUB/去ISG化活性。
[0049] 非结构蛋白nsp2的PLP2结构域是非常短的结构域：例如EAV毒株Bucyrus的 PLP2结构域由仅127个氨基酸组成（SEQ ID NO. : 9)，并且PRRSV毒株Lelystad的PLP2 结构域由仅136个氨基酸组成（SEQ ID NO. : 10)。
[0050] 例如PRRSV毒株VR-2332的PLP2结构域由139个氨基酸组成（SEQ ID NO. : 11)。
[0051] 图 3 描绘了关于 EAV 毒株 8以^1'118、？1??￥毒株1^178七3(1、？1??￥毒株￥1?-2332 和 PRRSV毒株GM2的PLP2结构域的序列比对（见下文）。图4显示基于其各自序列与EAV PLP2的比对，VR-2332和Lelystad的分子模型。一旦与EAV PLP2比对，这就允许VR-2332 或LV的序列置换到EAV PLP2晶体结构的3D骨架结构上。换言之，EAV PLP2结构域的氨 基酸侧链替换为VR-2332或LV的那些，如由多重序列比对指示的那样。由此，从头开始 建模缺失环，并且使用适当的能量最小化目标函数优化总体3D模型。
[0052] 使用如图3中给出的EAV的PLP2结构域的氨基酸序列编号，以便指示各个加框区 域。这种编号因此被称为PLP2结构域的"共有编号"。
[0053] 如本文定义的，可复制的动脉炎病毒是仍可以复制，即能够产生感染性子代病毒 的病毒。感染性子代病毒可以是可复制的感染性子代病毒或复制缺陷型的感染性子代病 毒。
[0054] 根据本发明可复制病毒非常适合作为活减毒的动脉炎病毒疫苗的基础。然而，为 了产生足够量的病毒用于疫苗中，子代病毒的量必须足够高。因此，为了本发明的目的，可 复制病毒是在敏感的细胞系统中产生一定量的子代病毒的病毒，所述量低于通过不含根据 本发明突变的相同病毒在相同细胞系统中产生的子代病毒量不超过3 1(llog。仅作为例子： 如果某一量的PRRSV毒株在某一细胞培养系统中产生1，000, 000个感染性子代病毒颗粒， 则携带根据本发明的突变的相同毒株必须产生1000个或更多个感染性颗粒，以取得作为 可复制病毒的资格。
[0055] 优选地，子代病毒的量低于不含根据本发明突变的病毒在相同细胞系统中产生的 子代病毒的量不超过2 1(llog。
[0056] 更优选地，子代病毒的量低于该量不超过I 1(llog。
[0057] 为了本发明的目的，具有减少的DUB/去ISG化活性的根据本发明的动脉炎病毒是 具有在PLP2结构域中的突变的病毒，从而使得所述病毒显示干扰素0 mRNA诱导增加至由 野生型病毒显示的干扰素0 mRNA诱导量的至少两倍的水平。
[0058] 在实施例部分中，给出实时定量PCR反应的描述，所述实时定量PCR反应可以用于 测定干扰素emRNA诱导的水平。在该实施例中，测试且比较了 EAV野生型病毒和根据本发 明的突变型的干扰素0 mRNA诱导水平。
[0059] 在RT-PCR中测试EAV IFN 0 mRNA的必需引物在表2中提供。在Artursson K等 人，J. Interferon Res. 12(3) :153-160(1992)中，提供了猪 IFN0 的序列，允许技术人 员设计用于实时PCR反应的相当引物，其可以用于测定根据本发明的PRRS病毒突变型的 IFN^mRNA诱导水平。
[0060] 在图9A中，显示例如，与不包含I353R突变的野生型病毒相比较，EAV突变型 I353R产生多达约4倍的IFN 0 mRNA。图9A中的三重突变型甚至产生与野生型病毒相比较 多达约8倍的IFN0mRNA。
[0061] 如由图6B可见的，突变型例如T312A已显示出下述的DUB活性水平，其导致比野 生型病毒的那种显著更致密的a-标记泳道（这代表剩余泛素缀合物的量）。邻近I353R 泳道（对于该泳道，图9A中显示相应的突变病毒产生与野生型病毒相比较高达约4倍的 IFN0 )显示高达T312A泳道的约两倍的a -标记泳道密度。
[0062] 出于这个原因，本发明人考虑这样的病毒，其在PLP2结构域中具有突变，从而使 得所述病毒显示干扰素0 mRNA诱导增加至由野生型病毒所示的干扰素0 mRNA诱导的量至 少两倍、优选四倍、更优选八倍的水平，以成为具有减少的DUB/去ISG化活性的病毒。
[0063] 为了本发明的目的，突变可以例如是替换、插入或缺失，如下所述。
[0064] 在图3中，给出了动脉炎病毒的四个不同实例的PLP2结构域的概述：EAV毒株 Bucyrus以及PRRSV毒株GM2, Lelystad和VR-2332。进行序列的比对并且将相关区域由框 标出。该图应与图2和4紧密连接来看。图2显示EAV的PLP2结构域的3D结构和泛素与 该结构结合的方式。图4显示PRRSV毒株Lelystad和VR-2332的PLP2结构域的预测的3D 结构和泛素与该结构结合的方式，并排地连同EAV毒株Bucyrus的PLP2结构域的晶体结构 用于比较。
[0065] 图3中用虚线加框的残基代表在活性位点附近与泛素的RLRGG基序相互作用的残 基。使这些残基突变可能影响PLP2结构域的多蛋白加工活性，并且因此应优选被避免。 [0066] 用粗线加框的残基代表与泛素的0 _抓握折叠（即，泛素的主体）直接结合的残 基，不接近活性位点。
[0067] 锌结合位点和紧邻于这个位点周围的残基形成PLP2结构域的泛素相互作用表面 的大部分，其结合泛素的0 -抓握折叠和很可能结合ISG15的C末端结构域的类似区域。
[0068] 如上所述（且如由图3中的比对可见的），是3D结构确定了哪些氨基酸残基形 成泛素相互作用表面。这是从图4C得出的，其中显示对于PRRSV毒株Lelystad，尤其是 Thr478、Val479和Val520被预测为与泛素结合，而对于PRRSV毒株VR-2332,该作用由 Ala486、Leu487