Wt1疫苗的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年12月13日提交的美国临时申请N〇.61/737,094的优先权，其 全部内容在此通过引用并入。
技术领域
[0003] 本发明涉及维尔姆斯肿瘤（Wilm's tumor) (WTl)免疫原和编码所述免疫原的核酸 分子。本发明还涉及包含此类WTl免疫原和/或核酸分子的疫苗。本发明还涉及使用所述 疫苗诱发免疫应答以及预防和/或治疗具有表达WTl的肿瘤的受试者的方法。
【背景技术】
[0004] 癌症仍然是美国和世界范围内死亡的主要原因。癌症疫苗市场正在迅速增长。淋 巴瘤疫苗占约0. 5%的市场份额。有效的肿瘤疫苗可用于以阻止肿瘤生长和/或可用作对 晚期癌症患者的标准治疗的更有效的、毒性更低的替代治疗。与癌症相关的抗原并因此为 抗肿瘤疫苗的靶是WTl。
[0005] 维尔姆斯肿瘤抑制基因I(WTl)被确定为肾脏胚胎恶性肿瘤的原因，影响约 1/10, 000的婴儿。其以散发性和遗传性形式发生。WTl的失活导致维尔姆斯肿瘤和 Denys-Drash综合征（DDS)的发生。结果是肾病以及可能的生殖器异常。已发现WTl蛋白 与许多细胞因子（包括主要肿瘤调控基因P53)相互作用，所述p53也是肿瘤抑制转录因 子。
[0006] WTl基因在许多肿瘤类型中表达并且已经更广泛地参与许多癌症。例如，WTl蛋白 被定位在75%的间皮瘤的细胞核（全世界每年14, 200例病例，在美国发病率最高）中和 93%的卵巢浆液性癌（2010年全世界190, 000例卵巢癌病例）中。此外，WTl已参与胰腺 癌、白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌以及良性间皮癌和宫颈癌及卵巢 癌等。WTl是作为癌症治疗的方法的基因疗法或免疫疗法的靶。
[0007] WTl编码在C末端上含有4个锌指基序并且在N末端上含有富含脯氨酸/谷氨酰 胺的DNA结合结构域的转录因子。其在泌尿生殖系统的正常发育中起到不可或缺的作用。 然而，其在成人中是不太必需的，从而表明其作为免疫疗法的靶。因在两个编码外显子上的 选择性剪接而产生的多个转录变体已得到很好地表征。利用整个阅读框架最大化CTL覆盖 将被认为是有利的。
[0008] 由于WTl抗原的保守性，因此大多数产生针对该基因靶的强免疫的努力未获成 功。先前已使用DAN疫苗技术、痘病毒疫苗技术、腺病毒疫苗技术、肽疫苗技术和基于蛋白 质的疫苗技术研宄了疫苗。被研宄的疫苗使用真实的基因结构，即天然的"正常"基因。在 这些研宄中仅实现低水平或无功能的T细胞免疫。
[0009] 对于更有效的WTl免疫原的开发存在几个主要问题。由于WTl抗原与宿主WTl的 相似性，因此产生强抑制子T细胞应答，从而阻断免疫诱导。此外，该基因本身在RNA水平被 显著加工，以便产生多个具有未知值和可能竞争值的经切割的转录物。此外，被递送的WTl 的表达很低，从而导致较差的免疫。
[0010] 用于治疗和预防癌症的疫苗受到极大的关注。现有靶向WTl的疫苗受到体内很差 的抗原表达限制。因此，在本领域仍然需要开发适用于表达WTl的肿瘤的安全有效的疫苗， 从而提供此类癌症的治疗和提尚所述癌症的存活率。
【发明内容】
[0011] 概述
[0012] 本发明涉及包含一种或多种核酸序列的经分离的核酸分子，所述核酸序列选自由 以下组成的组：编码SEQ ID NO:2的核酸序列、编码包含SEQ ID NO:2的长度的至少90%的 片段的核酸序列、编码与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的蛋白质的核酸序列、编码包 含与SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的蛋白质的长度的至少90%的片段的核酸序列、 编码SEQ ID N0:4的核酸序列、编码包含SEQ ID N0:4的长度的至少90%的片段的核酸序 列、编码与SEQ ID N0:4具有至少98%的同一性的蛋白质的核酸序列，以及编码包含与SEQ ID N0:4具有至少98%的同一性的蛋白质的长度的至少90%的片段的核酸序列。
[0013] 本发明还涉及包含一种或多种核酸序列的经分离的核酸分子，所述核酸序列选自 由以下组成的组：SEQ ID NO: 1、包含SEQ ID NO: 1的长度的至少90%的片段、与SEQ ID NO: 1具有至少98%的同一性的核酸序列、包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%的同一性的核 酸序列的长度的至少90%的片段、SEQ ID N0:3、包含SEQ ID N0:3的长度的至少90%的片 段、与SEQ ID NO: 3具有至少98%的同一性的核酸序列，以及包含与SEQ ID NO: 3具有至少 98 %的同一性的核酸序列的长度的至少90 %的片段。
[0014] 可将上述核酸分子掺入进质粒或病毒载体中。本发明还涉及包含一种或多种上述 核酸分子的组合物。本发明还涉及包含一种或多种上述核酸分子的疫苗。
[0015] 本发明还涉及治疗具有表达WTl的肿瘤的个体的方法，所述方法包括施用有效地 减缓表达WT1的肿瘤的生长、减小或消除所述肿瘤的量的上述疫苗。
[0016] 本发明还涉及预防个体的表达WTl的肿瘤的方法，所述方法包括施用有效地抑制 表达WTl的肿瘤的形成或生长的量的上述疫苗。
[0017] 本发明还涉及包含氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列选自由以下组成的组： SEQ ID NO: 2、包含SEQ ID NO: 2的长度的至少90%的片段、与SEQ ID NO: 2具有至少98% 的同一性的氨基酸序列、包含与SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的氨基酸序列的长度 的至少90%的片段、SEQ ID N0:4、包含SEQ ID N0:4的长度的至少90%的片段、与SEQ ID NO: 4具有至少98%的同一性的氨基酸序列，以及包含与SEQ ID NO: 4具有至少98%的同一 性的氨基酸序列的长度的至少90%的片段。
[0018] 本发明还涉及包含核酸分子的疫苗。所述核酸分子可包含在SEQ ID NO: 1中所示 的核酸序列的完整长度上具有至少约90%的同一性的核酸序列。所述核酸分子可包含在 SEQ ID N0:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约90%的同一性的核酸序列。所述 疫苗还可包含肽。所述肽可包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至 少约90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完 整长度上具有至少约90%的同一性的氨基酸序列。
[0019] 所述核酸分子可包含表达载体。所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。所述 疫苗还可包含佐剂。
[0020] 本发明还涉及包含核酸分子的疫苗。所述核酸分子可编码包含在SEQ ID NO:2中 所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90%的同一性的氨基酸序列的肽。所述核酸分 子可编码包含在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90%的同一性 的氨基酸序列的肽。所述疫苗还可包含肽。所述肽可包含在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸 序列的完整长度上具有至少约90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID N0:4 中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90%的同一性的氨基酸序列。
[0021] 所述核酸分子可包含表达载体。所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。所述 疫苗还可包含佐剂。
[0022] 本发明还涉及包含SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列的核酸分子。
[0023] 本发明还涉及包含SEQ ID N0:3中所示的核酸序列的核酸分子。
[0024] 本发明还涉及包含SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的肽。
[0025] 本发明还涉及包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的肽。
[0026] 本发明还涉及包含抗原的疫苗，其中所述抗原可由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3 编码。所述抗原可由SEQ ID NO: 1编码。所述抗原可由SEQ ID NO: 3编码。所述抗原可包 含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。所述抗原可包含SEQ ID NO: 2中所 示的氨基酸序列。所述抗原可包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列。
[0027] 本发明还涉及包含肽的疫苗。所述肽可包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列 的完整长度上具有至少约90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含在SEQ ID N0:4中所 示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约90%的同一性的氨基酸序列。所述肽可包含SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列。所述肽可包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列。
【附图说明】
[0028] 图1显示标绘免疫组对比每IO6个脾细胞的斑形成单位（SFU)的图。
[0029] 图2显示标绘免疫组对比每IO6个脾细胞的SFU的图。
[0030] 图3显示免疫印迹。
[0031] 图4显示ConWTl-L和ConWTl-S的示意图。
[0032] 图5显示ConWTl-L与ConWTl的各自氨基酸序列的比对。
[0033] 图6在（A)中显示编码ConWTl-L的核苷酸序列；和⑶ConWTl-L的氨基酸序列。
[0034] 图7在（A)中显示编码ConWTl-S的核苷酸序列；和⑶ConWTl-S的氨基酸序列。
[0035] 图8显示转染的细胞的染色。
[0036] 图9显示免疫印迹。
[0037] 图10显示说明免疫方案的示意图。
[0038] 图11显示标绘免疫组对比每IO6个脾细胞的SFU的图。
[0039] 图12显示标绘免疫组对比每IO6个脾细胞的SFU的图。
[0040] 图13显示经转染的细胞的染色。
[0041] 图14显示免疫印迹。
【具体实施方式】
[0042] 本发明涉及包含WTl抗原的疫苗。WTl在许多肿瘤中表达。因此，所述疫苗提供对 癌症或基于癌症的表达WTl的肿瘤的治疗。
[0043] WTl抗原可以是从来自不同物种的WTl的序列衍生的共有WTl抗原，从而，所述共 有WTl抗原是独特的。所述共有WTl抗原也是独特的，因为所述锌指被修饰或被一起去除。 修饰可包括配位锌结构的半胱氨酸和组氨酸残基的取代。
[0044] 令人惊讶地，当所述共有WTl抗原具有经修饰的锌指或无锌指时，诱发与WTl反应 的显著的免疫应答。诱发的免疫应答包括体液和细胞免疫应答，其中相对于或相较于被包 含天然WTl或针对表达优化的WTl的疫苗诱发的细胞免疫应答，所述细胞免疫应答被诱发 增强约400倍。
[0045] 1 ?定义
[0046] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员 理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件（包括定义）为准。下文中描述了优 选的方法和材料，尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料类 似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引 用整体并入。本文中公开的材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并非意在限制。
[0047] 如本文中所用，术语"包含/包括"、"包括"、"具有"、"有"、"可以"、"含有"及其变 型意欲为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文 另有明确说明，否则单数形式"一个（a) "、"和（and)"以及"该（the)"包括复数参考物。本 公开还涵盖"包含/包括"本文中提出的实施方案或组件、"由所述实施方案或组件组成"和 "基本上由所述实施方案或组件组成"的其它实施方案，无论是否明确地显示。
[0048] 如本文中所用的"佐剂"可意指添加至本文中描述的DNA质粒疫苗以增强一种或 多种由DNA质粒和下文中描述的编码核酸序列编码的抗原的抗原性的任何分子。
[0049] "抗体"可意指种类IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段的抗体、其片段或其衍生物， 包括Fab、F(ab'）2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可 以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗 体展现足够的对期望的表位或来源于其的序列的结合特异性。
[0050] "抗原"是指：具有包括SEQ ID NO:2的突变的WTl氨基酸序列的蛋白质；具有本 文中所示的长度的其片段、变体，即具有与如本文中所示的SEQ ID NO:2具有同一性的序列 的蛋白质、具有本文中所示的长度的变体的片段、SEQ ID N0:4;具有本文中所示的长度的 其片段、变体，即具有与如本文中所示的SEQ ID N0:4具有同一性的序列的蛋白质、具有本 文中所示的长度的变体的片段及其组合。抗原可任选地包含信号肽诸如来自其它蛋白质的 那些信号肽。
[0051] 如本文中所用，"编码序列"或"编码核酸"可指包含编码本文中所示的抗原的核苷 酸序列的核酸（RNA或DNA分子）。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个 体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件（包括启动子和多聚腺苷酸化信号）的起始和 终止信号。编码序列还可包括编码信号肽的序列。
[0052] 如本文中所用，"互补"或"互补的"可意指可核酸，可意指核酸分子的核苷酸或核 苷酸类似物之间的沃森-克里克（Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基 配对。
[0053] 如本文中所用，"共有"或"共有序列"可意指基于多个亚型的特定抗原的比对的 分析构建的合成核酸序列或对应的多肽序列。所述序列可用于诱发针对多个亚型、血清型 或株系的特定抗原的广泛免疫。合成抗原诸如融合蛋白可经操作成为共有序列（或共有抗 原）。
[0054] 如本文中所用，"恒定电流"定义由组织或限定所述组织的细胞在整个递送至相同 组织的电脉冲的持续过程中接收或经历的电流。从本文中描述的电穿孔装置递送电脉冲。 该电流在电脉冲的整个过程中在所述组织中维持恒定的安培度，因为本文中提供的电穿孔 装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。反馈元件可测量整个脉冲持续过程中组织（或 细胞）的电阻（resistance)，并使电穿孔装置改变其电能输出（例如，提高电压），这样相 同组织中的电流在整个电脉冲（大约数微秒）中以及在脉冲间维持恒定。在一些实施方案 中，反馈元件包括控制器。
[0055] 如本文中所用，"电流反馈"或"反馈"可互换使用，并且可意指提供的电穿孔装置 的主动响应，其包括测量组织中电极之间的电流和相应地改变由EP装置递送的能量输出， 以将电流维持在恒定水平。该恒定水平由用户在开始脉冲序列或电处理之前预先设定。反 馈可由电穿孔组件例如电穿孔装置的控制器来实现，因为其中的电路能够连续监测组织中 电极之间的电流并将该监测的电流（或组织内的电流）与预设电流相比较，以及连续进行 能量输出调整以将监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为其为模拟闭 环反馈。
[0056] 如本文中所用的"分散电流"可意指从本文中描述的电穿孔装置的各种针电极阵 列递送的电流的模式，其中所述模式使待电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激 的发生降至最低或优选消除。
[0057] 如本文中可互换使用的"电穿孔"、"电_透化"或"电动增强"（"EP"）可指使用 跨膜电场脉冲来诱发生物膜中的微观通路（孔）；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核 苷酸、SiRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。
[0058] 如本文中所用，"反馈机制"可指通过软件或硬件（或固件）进行的过程，该过程接 收期望的组织的阻抗（在递送能量脉冲之前，期间和/或之后）并将其与现有值（优选地 当前）相比较，随后调整被递送的能量的脉冲以达到预设值。可通过模拟闭环电路进行反 馈机制。
[0059] "片段"可意指能够引发哺乳动物的免疫应答的抗原的多肽片段。在具有或不具 有信号肽和/或位置1上的甲硫氨酸的每一种情况下，抗原的片段可与全长100%相同，除 从N和/或C末端失去至少一个氨基酸外。片段可包含20%或更多、25%或更多、30%或 更多、35%或更多、40%或更多、45%或更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或 更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91 %或更多、92%或 更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或 更多百分比的特定全长抗原的长度，不包括任何添加的异源信号肽。片段可包含多肽的片 段，所述多肽的片段与抗原具有95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99% 或更高同一性，并且额外地包含当计算百分比同一性时未被包括的N末端甲硫氨酸或异源 信号肽。片段还可包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或 IgG信号肽。可将N末端甲硫氨酸和/或信号肽连接于抗原的片段。
[0060] 在具有或不具有编码信号肽和/或位置1上的甲硫氨酸的序列的每一种情况下， 编码抗原的核酸序列的片段可与全长100%相同，除从5'和/或3'末端失去至少一个核苷 酸外。片段可包含20%或更多、25%或更多、30%或更多、35%或更多、40%或更多、45%或 更多、50%或更多、55%或更多、60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或 更多、85%或更多、90%或更多、91 %或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或 更多、96 %或更多、97 %或更多、98 %或更多、99 %或更多百分比的特定全长编码序列的长 度，不包括任何添加的异源信号肽。片段可包含编码多肽的片段，所述多肽与抗原具有95% 或