Wt1疫苗的制作方法_3

不同，从而提供针对表达WTl抗原的肿瘤的治疗或预防。因此，本文中提 供了与天然WTl基因不同的WTl抗原序列（即，突变的WTl基因或序列）。
[0098] 可将天然WTl基因的转录物加工成多种mRNA，并且所得的蛋白质对诱发免疫应答 不是完全等值的。本文中描述的突变的WTl基因避免选择性加工，从而产生一种完全长度 转录物并且导致对效应T细胞和B细胞应答更强的诱发。第一突变的WTI序列被称为具有 经修饰的锌指或ConWTl-L的CON WTl。SEQ ID NO: 1为编码具有经修饰的锌指的WTl抗原 CON WTl的核酸序列。SEQ ID NO:2为具有经修饰的锌指的WTl抗原CON WTl的氨基酸序 列。第二突变的WTl序列被称为不具有锌指或ConWTl-S的CON WTl。SEQ ID NO: 3为编码 不具有锌指的WTI抗原CON WTl的核酸序列。SEQ ID N0:4为不具有经修饰的锌指的WTl 抗原CON WTl的氨基酸序列。
[0099] 提供了包含上述异源序列的经分离的核酸分子。提供了由上述异源序列组成的经 分离的核酸分子。可将包含上述异源序列的经分离的核酸分子整合进载体诸如质粒、病毒 载体和如下文中描述的其它形式的核酸分子中。本文中提供编码WTl抗原的核酸序列。编 码WTl抗原的编码序列具有如上所述的序列。
[0100] 提供了包含上述异源氨基酸序列的蛋白质分子。提供了由上述异源氨基酸序列组 成的蛋白质分子。本文中提供了具有上述序列的蛋白质和多肽。所述蛋白质和多肽可被称 为WTl抗原和WTl免疫原。WTl抗原能够诱发针对表达WTl抗原的肿瘤的免疫应答。
[0101] 在本发明的一个方面，期望所述共有抗原提供提高的转录和翻译，包括下列的一 个或多个：增加转录的低GC含量前导序列；mRNA稳定性和密码子优化以及尽可能消除顺式 作用序列基序（即，内部TAT A盒）。
[0102] 在本发明的一些方面，期望产生共有抗原，所述共有抗原产生跨多个菌株的广泛 免疫应答，包括下列的一个或多个：整合所有可获得的全长序列；在每一个位置上利用最 常存在的氨基酸的计算产生的序列；和增强菌株之间的交叉反应性。
[0103] WTl抗原可以是来源于两个或更多个物种的共有抗原（或免疫原）序列。WTl抗原 可包含用于提高的表达的共有序列和/或修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、kozak 序列（例如，GCC ACC)的添加（以增加翻译起始）和/或免疫球蛋白前导序列的添加（以 增加WTl抗原的免疫原性）。WTl抗原可包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于 免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施方案中，WTl共有抗原可包 含血凝素（HA)标签。WTl共有抗原可被设计来引发比对应的密码子优化的WTl抗原更强和 更广的细胞和/或体液免疫应答。
[0104] WTl共有抗原在一个或多个锌指中可包含一个或多个突变，从而引发比对应的密 码子优化的WTl抗原更强和更广的细胞和/或体液免疫应答。一个或多个突变可以是在一 个或多个锌指中配位锌离子的一个或多个氨基酸的取代。配位锌离子的一个或多个氨基酸 可以是CCHH基序。因此，在一些实施方案中，所述一个或多个突变可替代CCHH基序的1、2、 3或所有4个氨基酸。
[0105] 在其它实施方案中，所述一个或多个突变是SEQ ID N0:2的残基312、317、342和 347是除半胱氨酸（C)外的任何残基以及SEQ ID NO:2的残基330、334、360和364是除组 氨酸01)外的任何残基的突变。具体地，所述一个或多个突变是SEQ ID N0:2的残基312、 317、330、334、342、347、360 和 364 为甘氨酸（6)的突变。
[0106] 在其它实施方案中，可从WTl共有抗原去除一个或多个锌指。可从WTl共有抗原 除去1、2、3或所有4个锌指。
[0107] WTl共有抗原可以是编码SEQ ID N0:2(图6A和6B)的核酸SEQ ID NO: 1。在一 些实施方案中，WTl共有抗原可以是在SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列的完整长度上具有 至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，1!1共有抗 原可以是编码在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0108] 在其它实施方案中，WTl共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列 的完整长度上具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的核酸序列， 只要SEQ ID NO: 2的残基312、317、342和347是除半胱氨酸（C)外的任何残基以及SEQ ID N0:2的残基330、334、360和364是除组氨酸（H)外的任何残基。在其它实施方案中，WTl 共有抗原可以是编码在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、 81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的核酸序列，只要SEQ ID N0:2的残基312、 317、330、334、342、347、360 和 364 为甘氨酸（G)。
[0109] WTl共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO: 2。在一些实施方案中，WTl共有抗原可 以是在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%的同一性的氨基酸序列。所述WTl共有抗原可以是在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸 序列的完整长度上具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列，只要 SEQ ID NO: 2的残基312、317、342和347是除半胱氨酸（C)外的任何残基以及SEQ ID NO: 2 的残基330、334、360和364是除组氨酸（H)外的任何残基。在一些实施方案中，WTl共有序 列可以是在SEQ ID N0:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、82%、 83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%或99%的同一性的氨基酸序列，只要SEQ ID N0:2的残基312、317、330、334、342、347、 360和364是甘氨酸（G)。
[0110] WTl共有抗原可以是核酸SEQ ID N0:3,其编码SEQ ID N0:4(图7A和7B)。在一 些实施方案中，WTl共有抗原可以是在SEQ ID N0:3中所示的核酸序列的完整长度上具有 至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，1!1共有抗 原可以是编码在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0111] WTl共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID N0:4。在一些实施方案中，WTl共有抗原可 以是在SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99 %的同一性的氨基酸序列。
[0112] 提供了 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%的SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:4。在一些实施 方案中，免疫原性片段可包含至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的SEQ ID NO: 2,只 要如果SEQ ID NO:2的残基312、317、342和347存在于免疫原性片段中，则这些残基是除 半胱氨酸（C)外的任何残基，以及只要如果SEQ ID N0:2的残基330、334、360和364存在 于免疫原性片段中，则这些残基是除组氨酸（H)外的任何残基。在其它实施方案中，免疫原 性片段可包含至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的SEQ ID NO:2,只要如果SEQ ID N0:2的残基312、317、330、334、342、347、360和364存在于免疫原性片段中，则这些残基是 甘氨酸（G)。
[0113] 在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如 免疫球蛋白E(IgE)前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。
[0114] 可提供含与SEQ ID N0:2和4的免疫原性片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质 的免疫原性片段。此类片段可包含至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、 至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的 与SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:4具有95%或更大的同一性的蛋白质。一些实施方案涉 及与本文中的WTl蛋白质序列的免疫原性片段具有96%或更大的同一性的免疫原性片段。 一些实施方案涉及与本文中的WTl蛋白质序列的免疫原性片段具有97%或更大的同一性 的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WTl蛋白质序列的免疫原性片段具有98% 或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WTl蛋白质序列的免疫原 性片段具有99%或更大的同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含 前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，所述免疫源性 片段不含前导序列。
[0115]-些实施方案涉及SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3的免疫源性片段。免疫源性片段 可包含至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO:3。在 一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列例如免疫球蛋白的前导序列诸如IgE前 导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。可提供 具有与SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3的免疫原性片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的 免疫原性片段。此类片段可包含至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、至 少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的与 SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:3具有95%或更高同一性的核酸。一些实施方案涉及与本 文中的WTl核酸序列的免疫原性片段具有96%或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方 案涉及与本文中的WTl核酸序列的免疫原性片段具有97%或更高同一性的免疫原性片段。 一些实施方案涉及与本文中的WTl核酸序列的免疫原性片段具有98%或更高同一性的免 疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WTl核酸序列的免疫原性片段具有99%或更高 同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列，例如免疫球 蛋白前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导 序列的编码序列。
[0116] b.载体
[0117] 所述疫苗可包含一种或多种包含编码所述抗原的异源核酸的载体。所述一种或多 种载体可以能够以有效地引发哺乳动物的免疫应答的量表达抗原。所述载体可包含编码所 述抗原的异源核酸。所述载体可具有含有复制起始点的核酸序列。所述载体可以是质粒、 噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述载体可以是自主复制的染色体外载体或 整合进宿主基因组的载体。
[0118] 所述一个或多个载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞的 质粒。一旦表达载体在细胞内，由所述基因编码的蛋白质由细胞转录和翻译机器核糖体复 合物产生。所述质粒通常被工程化以含有充当增强子和启动子区域调控序列并导致表达载 体上携带的基因的高效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，从而表达蛋白质。
[0119] 所述载体可具有表达信号诸如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆的基因之 间的距离的调整以及转录终止序列和PTIS (可携带的翻译起始序列）的插入。
[0120] (1)表达载体
[0121] 所述载体可以是环状质粒或线性核酸。所述环状质粒和线性核酸能够在适当的主 题细胞中指导特定核苷酸序列的表达。所述载体可具有有效地连接于编码抗原的核苷酸序 列的启动子，所述编码抗原的核苷酸序列可有效地连接于终止信号。所述载体还可含有核 苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其 组件的至少一个对于其至少一个其它组件是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组 成型启动子或诱导型启动子的控制之下，仅当将宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时 所述诱导型启动子才启动转录。在多细胞生物体的情况下，所述启动子还可于对特定的组 织或器官或发育阶段是特异性的。
[0122] (2)质粒
[0123] 所述载体可以是质粒。所述质粒可用于用编码抗原的核酸转染细胞，将该转化的 宿主细胞培养并在所述抗原的表达发生的条件下维持。
[0124] 所述质粒可包含编码一种或多种上文中公开的各种抗原的核酸序列，包括编码能 够引发针对抗原、此类蛋白质的片段、此类蛋白质的变体、变体的片段或融合蛋白（其由共 有蛋白和/或共有蛋白的片段和/或共有蛋白的变体和/或共有蛋白的变体的片段的组合 构成）的免疫应答的合成、共有抗原的编码序列。
[0125] 单一质粒可含有单一抗原的编码序列、两种抗原的编码序列、三种抗原的编码序 列或四种抗原的编码序列。
[0126] 在一些实施方案中，质粒还可包含单独的或作为一个这类质粒的一部分的编码 CCR20的编码序列。类似地，质粒还可包含IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。
[0127] 质粒还可包含可在编码序列的上游的起始密码子，和可在编码序列的下游的终止 密码子。所述起始和终止密码子可在具有编码序列的框内。
[0128] 所述质粒还可包含有效地连接于编码序列的启动子。有效地连接于编码序列的启 动子可以是来自猿猴病毒40 (SV40)的启动子、小鼠乳房肿瘤病毒（MMTV)启动子、人免疫 缺陷病毒（HIV)启动子诸如牛免疫缺陷病毒（BIV)长末端重复（LTR)启动子、莫洛尼病毒 (Moloney virus)启动子、禽类白血病病毒（ALV)启动子、巨细胞病毒（CMV)启动子诸如CMV 立即早期启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein Barr virus，EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒 (Rous sarcoma virus, RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因诸如人肌动蛋白、人 肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。所述启动子还可以是组织特 异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子（天然或合成的）。此类启动子的实例描述于美 国专利申请公开no. US20040175727中，其内容以其整体并入本文。
[0129] 所述质粒还可包含多腺苷酸化信号，其可位于编码序列的下游。所述多聚腺苷酸 化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素（bGH)多聚腺 苷酸化信号、人生长激素（hGH)多聚腺苷酸化信号或人0-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。所 述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒（Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺 苷酸化信号。
[0130] 所述质粒还可包含在编码序列的上游增强子。所述增强子可以是人肌动蛋白、人 肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强 子。多核苷酸功能增强子描述于美国专利No. 5, 593, 972、5, 962, 428和W094/016737中，其 各自的内容通过引用完全并入。
[0131] 所述质粒还可包含哺乳动物复制起始点以在染色体外维持质粒并在细胞中产生 多个拷贝的质粒。所述质粒可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAXI、pCEP4或 PREP4,所述