质粒可包含爱泼斯坦-巴尔病毒复制起始点和细胞核抗原EBNA-I编码区，其可 产生高拷贝附加型复制而无需整合。质粒的主链可以是PA V0242。所述质粒可以是复制缺 陷型腺病毒5型（Ad5)质粒。
[0132] 所述质粒还可包含调控序列，其可非常适合用于在施用了质粒的细胞中进行基因 表达。所述编码序列可包含可允许编码序列在宿主细胞中更高效转录的密码子。
[0133] 所述编码序列还可包含Ig前导序列。所述前导序列可以是编码序列的5''。由 该序列编码的共有抗原可包含N末端Ig前导序列和随后的共有抗原蛋白。所述N末端Ig 前导序列可以是IgE或IgG。
[0134] 所述质粒可以是pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)，其可用于在大肠杆菌 (Escherichia coli，E.coli)中产生蛋白质。所述质粒还可以是 p YES2(Invitrogen, San Diego, Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株中 产生蛋白质。所述质粒还可以是MAXBAC?完全杆状病毒表达系统（Invitrogen, San Diego，Calif.)的质粒，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。所述质粒还可以是pcDNA I 或pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞中产生蛋白质。
[0135] (3)环状和线性载体
[0136] 所述载体可以是环状质粒，其可通过整合进细胞基因组转化靶细胞或存在于染色 体外（例如，具有复制起始点的自主复制质粒）。
[0137] 所述载体可以是pVAX、pcDNA3. 0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并使得细 胞能够将所述序列翻译成被免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
[0138] 本文中还提供了能够经由电穿孔被有效地递送至受试者，并且表达一种或多种期 望的抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒（"LEC"）。所述LEC可以是不存在任何磷酸主链 的任何线性DNA。所述DNA可编码一种或多种抗原。所述LEC可含有启动子、内含子、终止 密码子和/或多腺苷酸化信号。所述抗原的表达可受启动子控制。所述LEC可以不含任何 抗生素抗性基因和/或磷酸主链。所述LEC可以不含与期望的抗原基因表达无关的其它核 酸序列。
[0139] 所述LEC可来源于任何能够被线性化的质粒。所述质粒可以能够表达抗原。所述 质粒可以是 pNP(Puerto Rico/34)或 pM2(New Caledonia/99)。所述质粒可以是 WLV009、 pVAX、pcDNA3. 0或provax，或任何其它能够表达编码所述抗原的DNA并使得细胞能够将所 述序列翻译成被免疫系统识别的抗原的表达载体。
[0140] 所述LEC可以是pcrM2。所述LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别来源于 pNP(Puerto Rico/34)和 pM2(New Caledonia/99)〇
[0141] (4)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
[0142] 所述载体可具有启动子。所述启动子可以是能够驱动基因表达和调控分离的核酸 表达的任何启动子。此类启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶的转录所需的顺式作用序列 元件，所述RNA聚合酶转录本文中描述的抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选 择取决于特定应用。可将启动子在载体中置于离转录起始位点与其在天然背景中离转录起 始位点的距离大约相同的距离。然而，再不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变 化。
[0143] 所述启动子可有效地连接于编码所述抗原和转录物的高效多腺苷酸化所需的信 号、核糖体结合位点和翻译终止的核酸序列。
[0144] 所述启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启 动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示对于在真核 细胞中的表达是有效的另一种启动子。
[0145] 所述载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。所述载体可 含有在结构基因下游的转录终止区以提供高效终止。所述终止区可获自与启动子序列相同 的基因或可获自不同的基因。
[0146] (5)制备载体的方法
[0147] 本文中提供了用于制备包含本文中论述的DNA疫苗的载体的方法。在通过最终的 亚克隆步骤克隆进哺乳动物的表达质粒后，可使用本领域已知的方法将所述载体用在大规 模发酵罐中接种细胞培养物。
[0148] 可使用已知的装置和技术的组合配制或制造在下文中更详细描述的与EP装置 一起使用的载体，但优选使用2007年5月23日提交的批准的、共同未决的美国临时申请 美国序列No. 60/939, 792中描述的优化的质粒制造技术来制造它们。在一些实例中，可以 大于或等于lOmg/mL的浓度配制用于这些研宄的DNA质粒。所述制造技术除了美国序列 No. 60/939792中描述的那些装置和方案（包括2007年7月3日授予的批准的专利、美国专 利No. 7, 238, 522中描述的那些装置和方案）之外，还包括或包含对于本领域普通技术人员 来说是公知的各种装置和方案。以上提及的申请和专利（分别为美国序列No. 60/939, 792 和美国专利No. 7, 238, 522)在此整体并入。
[0149] c.赋形剂和疫苗的其它组分
[0150] 疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子 诸如媒介物、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性 剂，诸如免疫刺激复合物（ISCOMS)、弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant)，LPS 类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、月旨 质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。
[0151] 转染促进剂是多聚阴离子、多聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐（LGS)或脂质。转染 促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸可以以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗 中。转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫刺激复合物（ISCOMS)、弗氏不完全佐剂，LPS 类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透 明质酸与基因构建体结合施用。所述DNA质粒疫苗还可包括转染促进剂，诸如脂质、脂质 体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物（参见例如 W09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进 剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐（LGS)或脂质。疫苗中的转染 剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于lmg/ml、低于0. 750mg/ml、低于0. 500mg/ml、低于 0? 250mg/ml、低于 0? 100mg/ml、低于 0? 050mg/ml 或低于 0? 010mg/ml。
[0152] 所述药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。所述佐剂可以是在可选择的 质粒中表达的其它基因或作为疫苗中与上述质粒组合的蛋白质被递送。所述一种或多种 佐剂可选自由以下组成的组：CCL20、a-干扰素（IFN-a)、0-干扰素（IFN-0)、y-干扰 素、血小板衍生生长因子（PDGF)、TNFa、TNF0、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、皮肤T细胞虏 获趋化因子（CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子（TECK)、粘膜相关上皮趋化因子（MEC)、 IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、 MIP-la、MIP-l ~、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-l、MadCAM-l、 LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50. 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、 IL-18的突变体形式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长 因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、 LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-1、 Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性 NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素 应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配 体、0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2、 IL-15(具有信号序列或编码缺失的信号序列的编码序列和任选地包含不同的信号肽诸如 来自IgE的信号肽或编码不同的信号肽诸如来自IgE的信号肽的编码序列），以及其功能性 片段或其组合。所述佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子 (PDGF)、TNFa、TNF 0、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、 IL-12、IL-18或其组合。
[0153] 在一些实施方案中，佐剂可以是一种或多种蛋白质和/或编码选自由CCL-20、 IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC 或 RANTES 组成的组的蛋白质的核酸分子。IL-12 构建体和序列的实例公开于PCT申请no. PCT/US1997/019502以及对应的美国申请序列 No. 08/956, 865和2011年12月12日提交的美国临时申请序列No 61/569600中，其各自 通过引用并入本文。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请no.PCT/US04/18962和 对应的美国申请序列No. 10/560,650中，以及PCT申请no. PCT/US07/00886和对应的美 国申请序列No. 12/160,766中和PCT申请no. PCT/USI0/048827中，其各自通过引用并入 本文。iL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请no. PCT/US09/039648和对应的美国申 请序列No. 12/936, 192中，其各自通过引用并入本文。RANTES以及其它构建体和序列的 实例公开于PCT申请no. PCT/US1999/004332和对应的美国申请序列No. 09/622452中， 其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请no. PCT/ US11/024098中，其通过引用并入本文。RANTES以及其它构建体和序列的实例公开于PCT 申请no. PCT/US1999/004332和对应的美国申请序列No. 09/622452中，其各自通过引用并 入本文。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请no. PCT/US11/024098中，其通过 引用并入本文。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体及序列的实例公开于PCT申请no. PCT/ US2005/042231和对应的美国申请序列No. 11/719,646中，其各自通过引用并入本文。0X40 和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请序列No. 10/560,653中，其通过引用并入本文。 DR5和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请序列No. 09/622452中，其通过引用并入本 文。
[0154] 可用作佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP_1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、 RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、 Mac-1、pl50. 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 的 突变形式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、 血管内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、 NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、 Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答 基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配体、 0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl、TAP2 及其 功能片段。
[0155] 所述疫苗还可包含如1994年4月I日提交的美国序列No. 021，579 (其通过引用 整体并入）中描述的基因疫苗促进剂。
[0156] 疫苗可以以约1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克，或优选地约0. 1微克至 约10毫克，或更优选约1毫克至约2毫克的量包含抗原和质粒。在一些优选实施方案中， 根据本发明的疫苗包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选实施方案中，疫苗可含 有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选实施方案中，疫苗可含有约0. 1至约500微克 的DNA。在一些优选实施方案中，疫苗可含有约1至约350微克的DNA。在一些优选实施方 案中，疫苗可含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克、约1微 克至约10毫克、约0. 1微克至约10毫克、约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、 约10纳克至约800微克、约0. 1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约 100至约200微克的抗原或其质粒。
[0157] 可按照待使用的施用模式配制疫苗。可注射疫苗药物组合物可以是无菌、无热原 和无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露 醇、山梨醇和乳糖。所述疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗 还可包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使得制剂在室温或环境温度长时间稳定，包 括LGS或聚阳离子或聚阴离子。
[0158] 3?疫苗的递送方法
[0159] 本文中提供了用于递送疫苗以提供遗传构建体和抗原的方法，所述抗原包含使得 它们特别有效地抗可诱发针对其的免疫应答的靶免疫原的表位。可提供递送疫苗或接种的 方法以诱发治疗性和预防性免疫应答。接种方法可在哺乳动物中产生针对所述抗原的免疫 应答。所述疫苗可被递送至个体以调节哺乳动物的免疫系统的活性和增强免疫应答。疫苗 的递送可以是将抗原作为在细胞中表达并被递送至细胞的表面上的核酸分子进行的转染， 免疫系统识别细胞表面上的所述抗原并诱发细胞、体液或细胞和体液应答。疫苗的递送可 用于通过向哺乳动物施用如上所述的疫苗以诱发或引发哺乳动物的针对所述抗原的免疫 应答。
[0160] 当将所述疫苗和质粒递送进哺乳动物的细胞时，所述转染的细胞将表达并分泌从 疫苗注射的每一种质粒的抗原。该抗原将被免疫系统识别为外来物，并且将针对它们产生 抗体。这些抗体将由免疫系统维持，并且允许针对所述抗原的有效应答。
[0161] 可向哺乳动物施用所述疫苗以引发哺乳动物的免疫应答。所述哺乳动物可以是 人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、 鹿、刺猬、大象、骆驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。
[0162] a.组合治疗
[0163] 可将所述疫苗与其它蛋白质和/或编码如下蛋白的基因组合施用：CCL20、a_干扰 素、y-干扰素、血小板衍生生长因子（PDGF)、TNFa、TNF0、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、皮 肤T细胞虏获趋化因子（CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子（TECK)、粘膜相关上皮趋化因 子（MEC)、IL-12、IL-15包括具有缺失的信号序列和任选地包含不同的信号肽诸如IgE信号 肽的 IL-15、MHC、CD80、CD86、IL-28、IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-I、 MIP-I a、MIP-I 0、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-I、 MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50. 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、 M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、 IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Ap〇-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、 Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、 c-jun、Sp-l、Ap-l、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性 NIK、SAP K、SAP-I、 JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、 RANK、RANK 配体、0x40、0x40 配体、