更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99%或更高的同一性，并且额外地任选地 包含当计算百分比同一性时未包括的编码N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可 包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码 序列。可将编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列连接于编码序列的片段。
[0061 ] 如本文中所用的"遗传构建体"是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分 子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调 控元件（包括启动子和多聚腺苷酸化信号）的起始和终止信号。如本文中所用，术语"可表 达的形式"是指基因构建体，所述基因构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的 必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。
[0062] 如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，"相同的"或"同一 性"可意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比： 将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基 的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及 将结果乘以1〇〇来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或 多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计 算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶（T)和尿嘧啶（U)认为是等同 的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST 2.0来获得同一性。
[0063] 当讨论反馈机制时可使用如本文中所用的"阻抗"，并且可按照欧姆定律将其转换 成电流值，从而使得能够与预设电流比较。
[0064] 如本文中所用的"免疫应答"可意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统， 响应一种或多种本文中描述的抗原（经由本文中描述的疫苗）的引入的激活。免疫应答可 以以细胞应答或体液应答的形式或这两种形式存在。
[0065] 如本文中所用的"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"可意指共价连接在一起的至 少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补 链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相 同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包 括在严格杂交条件下杂交的探针。
[0066] 核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基 因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及 碱基（包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和 异鸟嘌呤）的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。
[0067] 如本文中所用的"有效连接的"可意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的 控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'（上游）或3'（下游）。启动子与基因之间 的距离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。 如在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。
[0068] 如本文中所用的"肽"、"蛋白质"或"多肽"可意指氨基酸的连接的序列，并且可以 是天然的、合成的或者经修饰的或者天然和合成的组合。
[0069] 如本文中所用的"启动子"可意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合 成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序 列的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距 多达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆 虫和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育 阶段，或响应外部刺激（诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂）而组成型地，或差异地 调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体17启动子、噬菌体T3启动子、SP6 启动子、Iac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启 动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子和CMV IE启动子。
[0070] "信号肽"和"前导序列"在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的 蛋白质的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文中使 用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌后，通常从蛋 白质的其余部分（通常称为成熟蛋白）切割信号肽/前导序列。信号肽/前导序列连接在 蛋白质的N末端上。
[0071] 如本文中所用，"受试者"可意指想要或需要利用本文中描述的疫苗免疫的哺乳动 物。所述哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
[0072] 如本文中所用的"严格杂交条件"可意指第一核酸序列（例如，探针）将与第二核 酸序列（例如，靶）（诸如在核酸的复杂混合物中）杂交的条件。严格条件是序列依赖性的， 并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点（T m) 低约5-10°C作为严格条件。Tm可以是50%的与靶互补的探针在平衡（由于靶序列过量存 在，因此在T m下，50%的探针在平衡时被占据）时与靶序列杂交时的温度（在限定的离子强 度、pH和核酸浓度下）。严格条件可以是在pH 7.0至8. 3下盐浓度低于约LOM钠离子，诸 如约0? 01-1. OM的钠离子浓度（或其它盐）以及温度为至少约30°C (对于短探针（例如， 约10-50个核苷酸））和至少约60°C (对于长探针（例如，大于约50个核苷酸）的那些条 件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性 信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50%甲酰胺、5x SSC和1%SDS在42°C下孵育，或者5x SSC、1%SDS在65°C下孵育，在65°C于0. 2x SSC和 0? 1% SDS中洗涤。
[0073] 如本文中所用的"基本上互补的"可意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60%、65%、70%、75%、 80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %, 95%、96%、97%、98%或99%的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。
[0074] 如本文中所用的"基本上相同的"可意指如果第一序列与第二序列的补体基本上 互补的话则第一与第二序列在 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、 600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上或就核酸而言至少60%、 65 %,70 %,75 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。
[0075] 如本文中所用的"治疗"或"处理"可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的 方式来保护动物免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。 抑制疾病包括在疾病引发后但在其临床表现之前向动物施用本发明的疫苗。压制疾病包括 在疾病临床表现后向动物施用本发明的疫苗。
[0076] 本文中针对核酸所用的"变体"可意指（i)参考的核苷酸序列的部分或片段；（ii) 参考的核苷酸序列或其部分的补体；（iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸； 或（iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
[0077] 对于肽或多肽，"变体"是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列 上相异的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可意指具有与具有保留至少一种 生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保 守取代，即利用具有相似性质（例如，疏水性、带电区域的程度和分布）的不同氨基酸替 代氨基酸，在本领域中被认为通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可 部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数（hydropathic index)来鉴定。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本 领域中已知具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个 方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保 留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局 部平均亲水性，这是一种已被报导与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。美国专利 No. 4, 554, 101，通过引用完全并入本文。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸 的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸 进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致， 与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对 相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。
[0078] 变体可以是在全长的全基因序列或其片段上基本上相同的核酸序列。核酸序列 可在全长的基因序列或其片段上具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。变体可 以是在全长的氨基酸序列或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在全长的所 述氨基酸序列或其片段上具有 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的同一性。
[0079] 如本文中所用的"载体"可意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是质粒、噬 菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主 复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。
[0080] 对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例 如，对于6-9的范围，除了 6和9外还包括数值7和8,而对于范围6. 0-7. 0,明确地包括数 值 6. 0、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9 和 7. 0。
[0081] 2?疫苗
[0082] 本文中提供了包含抗原、其片段、其变体或其组合的疫苗。所述疫苗可以能够在哺 乳动物中产生针对所述抗原的免疫应答。所述疫苗可包含如在下文中更详细描述的质粒或 多种质粒。所述疫苗可诱发治疗性或预防性免疫应答。
[0083] 所述疫苗可用于抵抗癌症例如表达维尔姆斯肿瘤抑制基因I(WTl)的癌症或肿 瘤。所述疫苗可用于预防和/或治疗有此需要的受试者的表达WTl的肿瘤。所述疫苗可诱 发针对WTl和表达WTl的肿瘤的细胞和/或抗体应答。
[0084] 所述疫苗可诱发或引发施以所述疫苗的受试者的免疫应答。施以所述疫苗的受 试者的免疫应答可被诱发至少约40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200 倍、225 倍、250 倍、275 倍、300 倍、325 倍、350 倍、375 倍、400 倍、425 倍、450 倍、475 倍、500 倍、525 倍、550 倍、575 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、1000 倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍或4000倍。在一些实施方案中，施以所述疫 苗的受试者的免疫应答可被诱发至少约300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450 倍、475倍或500倍。
[0085] 所述疫苗可诱发施以所述疫苗的受试者的体液和/或细胞免疫免疫应答。所述诱 发的体液免疫免疫应答可包括与所述抗原免疫免疫应答的抗体。所述诱发的免疫应答可包 括产生干扰素-Y(IFN-Y)并且与所述抗原免疫免疫应答的T细胞。施以所述疫苗的受试 者的细胞免疫免疫应答可被诱发至少约40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150 倍、200 倍、225 倍、250 倍、275 倍、300 倍、325 倍、350 倍、375 倍、400 倍、425 倍、450 倍、475 倍、500 倍、525 倍、550 倍、575 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍或4000倍。在一些实施方案中，施 以疫苗的受试者的细胞免疫应答可被诱发至少约300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425 倍、450倍、475倍或500倍。
[0086] 所述疫苗可用于递送一种或多种选自由抗原、此类抗原的片段、此类抗原的变体 和变体的片段组成的组成的抗原。在多种抗原的递送的情况下，所述疫苗可包括多种组合 物或单一组合物。递送可包括可用于编码多种不同的抗原或相同抗原的不同部分的单一质 粒。在其它实施方案中，递送可包括编码不同抗原或相同抗原的不同部分的不同质粒。
[0087] 所述疫苗可以是核酸疫苗、肽疫苗或核酸和肽的组合疫苗。所述核酸疫苗可包含 核酸分子。所述核酸疫苗可包含多个拷贝的单一核酸分子诸如单一质粒、多个拷贝的两种 或更多种不同的核酸分子诸如两种或更多种不同的质粒。
[0088] 所述核酸疫苗可包含核酸分子诸如质粒，其可共同地含有单一抗原的编码序列、 两种或更多种抗原的异源编码序列。包含两种抗原的异源编码序列的核酸疫苗可在单一 核酸分子诸如单一质粒上，或所述核酸疫苗可包含两种不同的核酸分子诸如两种不同的质 粒，其中一种核酸分子包含一种抗原的异源编码序列并且另一种核酸分子包含不同抗原的 异源编码序列。所述核酸疫苗可包含两种不同的核酸分子诸如两种不同的质粒，其中一种 核酸分子包含所述抗原的第一部分的异源编码序列并且另一种核酸分子包含所述抗原的 第二部分的异源编码序列。
[0089] 类似地，包含3种抗原的异源编码序列的核酸疫苗可包含单一核酸分子诸如单一 质粒、2种不同的核酸分子或3种不同的核酸分子。同样地，包含4种抗原的异源编码序列 的核酸疫苗可包含单一核酸分子诸如单一质粒、2种不同的核酸分子、3种不同的核酸分子 或4种不同的核酸分子。
[0090] 所述核酸疫苗可包含一种或多种编码抗原的核苷酸序列。所述核酸序列可以是 DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包含编码通过肽键连接于所述 抗原的接头、如导序列和/或标签序列的额外序列。
[0091] 在一些实施方案中，所述核酸疫苗还可包含分子佐剂的编码序列，在一些情况下 所述分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，以及在一些情况下 所述分子佐剂为检查点抑制剂，包括抗细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗-程序化死 亡受体-I(PD-I)和抗-淋巴细胞-活化基因（LAG-3)。可在一种或多种包含一种或多种抗 原的编码序列的核酸分子上包含IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码 序列。可在单独的核酸分子诸如单独的质粒上包含IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和 /或RANTES的编码序列。
[0092] 所述肽疫苗可包括抗原性肽、抗原性蛋白质、其变体、其片段或其组合。组合DNA 和肽疫苗可包含上述一种或多种编码抗原和抗原性肽或抗原性蛋白质的核酸序列。
[0093] 本发明的疫苗可具有有效疫苗的期望特性，诸如是安全的以便所述疫苗本身不引 起疾病或死亡；具有抵抗疾病的保护作用；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞；以及提供施 用的容易性、几乎无副作用、生物稳定性和每剂量的低成本。
[0094] a?抗原
[0095] 如本文中所描述的，所述疫苗可包含抗原。抗原可以是维尔姆斯肿瘤抑制基因 I (WTl)、其片段、其变体或其组合。WTl是在N末端上含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结 合结构域和在C末端上含有4个锌指基序的转录因子。WTl在泌尿生殖系统的正常发育中 起着作用，并且与许多因子例如，P53( -种已知的肿瘤抑制子）和丝氨酸蛋白酶HtrA2(其 可在用细胞毒性药物处理后在多个位点上切割WT1)相互作用。
[0096] WTl的突变可导致肿瘤或癌症例如维尔姆斯肿瘤或表达WTl的肿瘤的形成。维尔 姆斯肿瘤通常在转移至其它组织例如但不限于肝组织、尿道系统组织、淋巴组织和肺组织 之前在一个或两个肾中形成。因此，维尔姆斯肿瘤可被认为是转移性肿瘤。维尔姆斯肿瘤 通常发生在年幼儿童（例如，小于5岁）中并以散发性和遗传性形式发生。
[0097] 因此，所述疫苗可用于治疗患有维尔姆斯肿瘤的受试者。所述疫苗还可用于治疗 具有表达WTl的癌症或肿瘤的受试者以预防此类肿瘤在受试者中发展。WTl抗原可与天然 的"正常ITl基因