A-MB-231细胞。用抗GFP抗体（或不用抗体；-Ab)使细胞裂解物进行免疫沉淀，然后 连同细胞裂解物样品（5% ) -起，用指定抗体做免疫印迹。图5F-将细胞接种于纤连蛋白 上，固定并免疫染色内源Racl。比例尺，ΙΟμπι。图5G-在用NSC-23766(5 yM)进行30min 长的处理前5min和处理后5min，使用共聚焦显微镜术为细胞成像。图5H-用指定siRNA 寡聚核苷酸处理MDA-MB-231细胞。为细胞提取物的SYNJ2和Ras-GAP做印迹。使用基于 ELISA的测定法测定GTP-Racl水平（细胞骨架）。
[0036] 图6A-D显示SYNJ2向前缘的定位与小窝蛋白分布不同并且取决于F-肌动蛋白、 胆固醇和PI3K。图6A-随时间推移同时为表达GFP-SYNJ2和共表达RFP-Cavl的MDA-MB-231 细胞成像，并将信号转换成波动曲线（X和Y轴）。注意SYNJ2组件的瞬时性质和小窝蛋白 1的稳定外观。比例尺，5μπι。图6B-左图描绘了如图5A中成像（间隔5s，单平面、转盘式 共聚焦）的150种随机选择的SYNJ2组件的分布（相对于寿命的小窝％ )。右图描绘了显 示55s寿命的组件的平均（土SEM)相对强度。图6C-用Μβ CD(10mM，15min)或渥曼青霉素 (500nM，15min)处理稳定表达GFP-SYNJ2的MDA-MB-231细胞。在处理之前或之后每6s捕 捉所选相同细胞的图像，并将信号转换成波动曲线（表示左图中的正方形插图）。比例尺， 20 μ m。图 6D-用拉春库林 B (Latrunculin B) (1 μ M，15min)处理稳定共表达 GFP-SYNJ2 和 IifeACTiCherry的MDA-MB-231细胞。在处理之前或之后获取图像。比例尺，5 μπι。
[0037] 图7Α-Ε显示SYNJ2损耗使EGFR留在细胞内囊泡中。图7Α-接种于含EGF的培养 基中3天后，提取稳定表达shRNA对照（shCtrl)或对SYNJ2有特异性的shRNA(shSYNJ2) 的MCFlOA细胞。探测SYNJ2、EGFR、EGFR磷酸化酪氨酸1068 (pEGFR)、磷酸化ERK(pERK)和 作为上样对照的Ras-GAP的免疫印迹。图7B-在EGF的存在下，用siRNA对照或针对SYNJ2 的siRNA转染MCFlOA细胞。使用EGFR和SYNJ2抗体进行共聚焦免疫荧光分析。注意仅 SYNJ2缺乏型细胞（星号）显示出EGFR运输缺陷。比例尺，10 μπι。图7C-为MDA-MB-231 细胞的三种衍生细胞的EGFR免疫染色而DAPI和F-肌动蛋白复染：（i)其中SYNJ2敲减的 细胞（shSYNJ2;左边一列），（ii)通过与催化非活性形式相对应的慢病毒基因转移感染的 相同细胞（shSYNJ2+SYNJ2 m;中间一列），和（iii)其中SYNJ2敲减并通过感染引入野生型 形式的细胞（shSYNJ2+SYNJ2 WT;右边一列）。比例尺，20 μ m。图7D-泛素化EGFR水平（密 度测定法）。图7E-用488-Tfn刺激MDA-MB-231衍生细胞（5min，10 μ g/mL)。将细胞于冰 上固定，经酸洗并分析信号强度。
[0038] 图8A-I显示SYNJ2调节EGFR运输和趋化性。图8A-按指示，为用指定siRNA转 染的MDA-MB-231细胞的全部提取物做免疫印迹。图8B-指定MDA-MB-231亚克隆的表面 EGFR的FACS(左）和125I-EGF结合（右；一式三份）分析。图8C-使shCtrl和shSYNJ2 细胞在纤连蛋白上生长并对EGFR和F-肌动蛋白免疫染色。比例尺，20ym。图8D-暴露 于EGF梯度后，在趋化小室内迀移的shCtrl和shSYNJ2 MDA-MB-231细胞的轨迹玫瑰图。 红色轨迹指细胞向EGF迀移。图8E-用EGF (10ng/mL)处理饥饿MDA-MB-231衍生细胞并 且按指示将细胞裂解物进行免疫沉淀和免疫印迹。图8F-与C中一样，培养细胞并对活性 EGFR(pY1045)和F-肌动蛋白免疫染色。比例尺，ΙΟμπι。图8G-用EGF(10ng/ml)处理指定 MDA-MB-231衍生细胞5h并且按指示为提取物做免疫印迹。图8H-将指定MDA-MB-231衍 生细胞暴露于Alexa Fluor 488-Tfn(25μg/ml;5min)，酸洗以去除表面结合的配体，并以 指定时间间隔拍摄图像。示出了归一化焚光信号。比例尺，l〇ym。图81-用Alexa Fluor 488-EGF(20 μ g/ml ;10min)刺激经 siCtrl 或 siSYNJ2 预处理的 MDA-MB-231 细胞，酸洗，在 37°C下培养指定时间间隔并通过FACS分析。
[0039] 图9A-D显示SYNJ2对于囊泡运输和粘着斑形成是必需的。图9A-固定MDA-MB-231 衍生细胞（shCtrl和shSYNJ2)并对EEA1、F-肌动蛋白和细胞核（DAPI)染色。比例尺， ΙΟμπι。图9B-为MDA-MB-231衍生细胞，即shCtrl和shSYNJ2细胞探测整联蛋白β-1、 F-肌动蛋白和DAPI (比例尺，20 μ m)。图9C-用siCtrl和siSYNJ2处理MDA-MB-231细胞 48h，然后对整联蛋白β -1和磷酸化EGFR免疫染色。图9D-MDA-MB-231衍生细胞的粧蛋 白、细胞核（DAPI)和F-肌动蛋白的免疫荧光分析（使用TRITC-鬼笔环肽）。在胞质区内 相对于粘着斑量化粧蛋白信号，并且还量化了每个细胞粘着斑的数量。另外，通过测定与完 整圆的偏差（偏心率）量化粘着斑的形状。
[0040] 图10A-F显示SYNJ2损耗扰乱了磷酸肌醇体内平衡，使初级内体充气并分解粘着 斑。图10Α-用GFP-Rab4质粒转染表达shCtrl或shSYNJ2的MDA-MB-231细胞并且在48h 后固定细胞并使用TRITC-鬼笔环肽对F-肌动蛋白复染。图10B-对MDA-MB-231衍生细胞 的Rab5、F-肌动蛋白和细胞核（DAPI)免疫染色。量化图像中Rab5阳性囊泡的尺寸和数 量以及平均细胞面积。比例尺，1〇μπι。图10C-通过色谱法分离从 3H-磷酯酰肌醇标记的 MDA-MB-231细胞衍生细胞中提取的磷酸肌醇并且在3次不同实验中测定其水平（信号归一 化为 shCtrl 细胞）。图 IOD-探测 shCtrl 和 shSYNJ2 MDA-MB-231 细胞的 pY1068-EGFR、粧 蛋白和-肌动蛋白（共定位信号为白色）。比例尺，10 μ m。图IOE-接种shCtrl和shSYNJ2 MDA-MB-231细胞。20min后去除独立细胞并且为贴壁细胞成像并量化其表面积。图IOF-在 RTCA E板上接种稳定表达shCtrl或shSYNJ2的MDA-MB-231细胞并且间隔5s记录实时阻 抗测量80min，然后间隔IOmin再记录80min。示出了 2次重复的平均值（±S.D.)。
[0041] 图IlA-G显示SYNJ2调节蛋白酶分泌和侵袭伪足装配。图IlA-在Matrigel中 培养shCtrl和shSYNJ2 MDA-MB-231细胞5天，固定并对MMP-9免疫染色。将信号强度转 换成热图并根据与菌落核心的距离绘图。箭头标记球体边界。比例尺，50μπι。图IlB-使 用明胶酶谱法分析来自对照MDA-MB-231细胞和稳定表达SYNJ2的细胞的上清液的ΜΜΡ-2 和MMP-9活性，一式三份。图IlC-将稳定表达GFP-SYNJ2的MDA-MB-231细胞涂到预先涂 有交联荧光明胶的盖玻片上。3h后，探测细胞的GFP和F-肌动蛋白，并检测侵袭伪足结构 (箭头）。比例尺，10 μ m。图IlD-将过表达SYNJ2 (SYNJ2-0X)的MDA-MB-231细胞以及经 SiCtrl或siSYNJ2寡聚核苷酸预处理的细胞涂到预先涂有交联荧光明胶的盖玻片上并且 在3次独立实验中量化侵袭伪足结构。图IlE-通过明胶降解，以及通过对F-肌动蛋白或 TKS5染色检测经指定siRNA处理的MDA-MB-231细胞的侵袭伪足结构。箭头（Z轴图像）标 记侵袭伪足。比例尺，10 μ m。图IlF-将表达siCtrl或siSYNJ2的MDA-MB-231细胞涂到 涂有明胶的盖玻片上并且与C中一样使用鬼笔环肽和EGFR磷酸化形式（酪氨酸1068)的 抗体加工。比例尺，10 μπι。图IlG-使用基于ELISA的测定法检查用指定MDA-MB-231衍生 细胞调节3天的培养基的EGF样配体。
[0042] 图12A-G显示SYJN2调苄基质降解和侵袭伪足装配。图12A-接种经指定siRNA 处理的MDA-MB-231细胞，培养3天并且使用明胶（0. 1 % )包埋凝胶经电泳分离其条件 培养基，接着蛋白质染色以量化MMP-2和MMP-9蛋白水解活性。图12B-使用稳定表达 GFP-SYNJ2的MDA-MB-231细胞的GFP偶联珠粒和澄清提取物进行的免疫共沉淀分析。图 12C-用RFP-皮动蛋白质粒转染稳定表达GFP-SYNJ2的MDA-MB-231细胞并接种于胶原板 上。48h后进行活细胞图像分析，并且捕捉外围和中央细胞区域的代表性快照图像。比例 尺，5 μ m。图12D-用编码Tappl (-种PI (3, 4) P2结合剂）的经Myc标记的PH结构域的质 粒转染MDA-MB-231细胞的指定衍生细胞并且在48h后，将其接种在涂有明胶的表面。使用 共聚焦显微镜术目测F-肌动蛋白、聚集的TKS5和PI (3, 4) P2 (Tappl)的共同分布并且量化。 比例尺，10 μ m。
[0043] 图12E-将表达siCtrl或siSYNJ2的MDA-MB-231细胞接种到涂有FITC-明胶的盖 玻片上并培养3h。然后固定细胞并对⑶44免疫染色，并且用TRITC-鬼笔环肽对F-肌动蛋 白复染。使用荧光显微镜术目测细胞，并且在FITC-明胶基质中通过观察孔检测侵袭伪足。 加框区域放大。比例尺，10 μπι。图12F-⑶44的抗体用于shCtrl和shSYNJ2细胞表面表达 的FACS分析。指出了与加框区域相对应的细胞的分数。图12G-将用siCtrl或siSYNJ2 预处理的MDA-MB-231细胞接种到涂有FITC-明胶的盖玻片上并培养3h。然后固定细胞并 对MTl-MMP免疫染色，并且用TRITC-鬼笔环肽对F-肌动蛋白复染。比例尺，10 μ m。
[0044] 图13A-H显示SYNJ2的酶活性驱使乳腺肿瘤细胞转移扩散。图13A-在雌性SCID小 鼠（每组10-11只）的脂肪垫上植入表达RFP的MDA-MB-231细胞的指定衍生细胞（2 X IO6 个/只小鼠）。移植2和6周后测量肿瘤大小（平均值土S.D.)。图13B-C-示出了移植 6周后在腋窝和远侧淋巴结（图13B)或肺部（图13C)中出现的转移。星号标记p值： *〈0. 05，#〈0.0 l和*#〈0. 001。图13D-F-与A中一样，在动物体内植入过表达对照（LacZ) 和SYNJ2 (SYNJ2-OX)、经RFP标记的MDA-MB-231细胞并且在移植6和8周后量化肿瘤大小 (图13D)以及向淋巴结（图13E)和肺部（图13F)的转移。图G-H-经静脉（I. 5X IO5个 /只小鼠；尾静脉）或在5周龄雌性SCID小鼠的乳腺脂肪垫内（2. 5X IO6个/只小鼠），注 射指定MDA-MB-231-RFP衍生细胞。4周后，检查来自经静脉注射的小鼠的肺部的RFP信号 (左侧和中间的图）。4周后从脂肪垫处理组收集外周血。按ficol梯度纯化样品并且每 IxlO6个FACS读数为RFP阳性循环肿瘤细胞的数量评分并归一化为肿瘤重量。
[0045] 图14为局部和远侧淋巴结转移的活体成像。接种了 MDA-MB-231-RFP细胞并于6 周后分析的小鼠体内局部（同侧）和远侧（对侧）淋巴结转移的代表性图像（见图13B)。 成像之前，麻醉小鼠并去除其毛皮以便目测和量化淋巴结内的转移。
[0046] 图15是描绘SYNJ2在细胞迀移和侵袭中的综合作用的工作模型。载EGFR的再循 环核内体将活性受体定位在腹侧膜处，并且在这之后局部激活PI3K。PI3K对膜PI (4, 5) P2 的磷酸化生成PI (3, 4, 5) P3, PI (3, 4, 5) P3S SYNJ2脱去磷酸成为PI (3, 4) P2。后者募集TKS5， 这样锚定皮动蛋白并对肌动蛋白聚合起核心作用。同时，SYNJ2控制粘着分子如CD44和蛋 白酶如MTl-MMP的递送，以降解细胞外基质（ECM)并建立新的侵袭结构，侵袭伪足。以类似 方式，EGFR向细胞外周的递送导致PI (4, 5)己受SYNJ2 (和磷脂酶C)分解，这样局部激活了 发动蛋白和肌动蛋白切割酶如丝切蛋白以溶解皮层肌动蛋白纤维并引发肌动蛋白填充的、 富含整联蛋白的突出，称为板状伪足。水平箭头标记细胞迀移的方向。质膜的彩色编码部 分指特定PI磷脂。
[0047] 图16A-C-显示SYNJ2在侵蚀性乳腺肿瘤中高度表达。图16A-根据SYNJ2丰度 (高、中和低），使用免疫组织化学和组织微阵列为331例侵袭性乳腺癌分层。根据临床亚型 提出肿瘤的相对分数。图16B-展示在细胞腔情况下（星号标记作为对照的内皮细胞的表 达）及在基底样和HER2过表达乳腺肿瘤中观察到的强度和模式（右侧一列放大）的SYNJ2 染色的代表性图像。图16C-根据286名（左侧；GSE2034)或99名（右侧；GSE19783)乳腺 癌患者组群中的SYNJ2 mRNA表达分层的Kaplan-Meier曲线。
[0048] 图17A-B示出了用于测量SYNJ2的5'-磷酸酶活性的荧光偏振测定法的原理。图 17A是展示未结合PI (3, 4) P2荧光探针产生低偏振读数，而结合PI (3, 4) P2荧光探针使偏振 读数增大的一般原理的示意图。图17B是显示通过偏振度（mP)测量的SYNJ2 5' -磷酸酶 活性检测的代表性柱状图。
[0049] 图18描绘了克隆到pET28质粒中并且在大肠杆菌（E. coli)中表达的Flag-TAPPl PH结构域-His的氨基酸和核酸序列（分别为SEQ ID NO: 13和14)。TAPPl-PH结构域标记 为黄色。