l:372-85(1999)]，而 经由靶向c-myb基因、p53和Bcl-2的反义寡核苷酸治疗血液恶性肿瘤已进入临床试验并 且已经证实患者耐受[Gerwitz Curr Opin Mol Therl :297-306 (1999)]。
[0144] 最近，已经报道在小鼠模型中反义介导的人乙酰肝素酶基因表达抑制，抑制了人 癌细胞的胸膜种植转移[Uno等，Cancer Res 61:7855-60(2001)]。
[0145] 因此，目前的共识是在如上所述，已导致产生高度精确的反义设计算法和各种寡 核苷酸递送系统的反义技术领域的最新发展，使得普通技术人员能够设计并实现适合下调 已知序列的表达，而无需采取不当试验和错误实验的反义方法。
[0146] 能够下调SYNJ2的另一种试剂是能够特异性裂解编码SYNJ2的mRNA转录产物的 核酶分子。核酶正越来越多地用于通过裂解编码目标蛋白的mRNA，序列特异性抑制基因 表达[Welch等，Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。将核酶设计为裂解任何特定 靶RNA的可能性已使其在基础研宄和治疗应用中成为宝贵的工具。在治疗领域，核酶已 开发用于靶向传染病中的病毒RNA、癌症中的显性致癌基因和遗传病中的特定体细胞突变 [Welch等，Clin Diagn Virol. 10:163-71(1998)]。最为显著的是，HIV患者的几种核酶基 因疗法已经处于1期试验。最近，核酶已经用于转基因动物研宄、基因靶标验证和途径说 明。几种核酶处于临床试验的不同阶段。ANGI0ZYME是要在人类临床试验中研宄的首个经 化学合成的核酶。ANGI0ZYME特异性抑制VEGF-r (血管内皮生长因子受体），血管生成途 径中的一种关键组分的形成。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.以及其它公司已经证明 了抗血管生成疗法在动物模型中的重要性。在细胞培养测定法中发现HEPTAZYME，设计为 选择性破坏丙型肝炎病毒（HCV)RNA的一种核酶，减少丙型肝炎病毒RNA有效（Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated-WEB 首页）。
[0147] 能够下调SYNJ2的另一种试剂将为结合和/或裂解SYNJ2的任何分子。
[0148] 本发明揭开了成为SYNJ2在细胞运动中的作用基础的一般机理。
[0149] 图15中列出了原理。相应地，关键事件需要EGF诱导的SYNJ2上调及由此引起的 3 种磷酸肌醇损耗：PI (4, 5)P2、PI (3, 4, 5)P3和 PI (3, 5)P 2。SYNJ2 介导的 PI (4, 5)P2脱磷酸 与PI (4, 5)己受磷脂酶C- γ降解和受PI3K磷酸化并行，这样生成PI (3, 4, 5) P 3。总的来说， 3种酶受EGF的刺激使一组PI (4, 5) P2结合剂从质膜离解，并且还生成无 PI (4, 5) P 2的内吞 囊泡。同时，SYNJ2将PI (3, 4, 5)P3R化成侵袭伪足形成所必需的PI (3, 4)Ρ2。一旦到位， PI (3, 4)P2就结合TKS5并且使以发动蛋白和皮动蛋白为中心的复合物成核，该复合物使得 丝切蛋白能够在侵袭伪足内产生肌动蛋白钩端。根据本结果，SYNJ2也涉及下一侵袭伪足突 变步骤，即MMP分泌及MTl-MMP和其它表面分子例如⑶44的递送。以类似方式，SYNJ2控 制EGFR和整联蛋白向前缘的递送，并且很可能激活丝切蛋白，这是指示板状伪足突出形成 的关键事件。
[0150] 这些发现可用于鉴定为肿瘤转移推定抑制剂的SYNJ2抑制剂。
[0151] 因此，根据本发明的一方面，提供了一种鉴定肿瘤转移的推定抑制剂的方法，所述 方法包括在试验试剂的存在下，分析SYNJ2介导的PI (3, 4, 5#3向PI (3, 4)P 2的加工，其中 在所述试验试剂的所述存在下PI (3, 4, 5) ?3向PI (3, 4) P 2的加工，与其不存在时PI (3, 4, 5) ?3向PI (3, 4)P 2的加工相比减少，表明为肿瘤转移的推定抑制剂。
[0152] 试验试剂可为生物分子（蛋白质（例如肽或抗体）、核酸分子（例如沉默剂）、碳 水化合物、脂质或其组合）或小分子（例如，化学品）。
[0153] 所述方法可在体内或体外实现。后者可在细胞体系中或使用无细胞体系执行。
[0154] 示例性测定法牵涉通过竞争测定法分析SYNJ2介导的PI (3, 4, 5) ?3向PI (3, 4) P 2 的加工。
[0155] 相应地，竞争测定法测试PI (3, 4) P2结合结构域从包含与PI (3, 4) P 2结合的 PI (3, 4)P2g合结构域的复合物的位移。
[0156] 根据一示例性实施方案，采用荧光偏振竞争测定法。所述测定法依赖一旦分子结 合更大的隔绝元件（例如，蛋白质），其在空间上的运动就显著降低的原理。可使用允许在 从样品的平行和垂直平面测量后，测定荧光偏振的荧光探针检测和测量这种现象。相应地， 溶液中未结合的荧光分子产生极低偏振读数，但是向溶液添加结合（隔绝）这些分子的检 测剂（例如，结合蛋白）时，荧光分子在增大溶液中的偏振读数的受限组合物中稳定。
[0157] 例如，所述测定法可包括PI (3, 4) P2结合结构域（例如，PH-结构域例如TapplPH 结构域，SEQ ID NO: 15-16)和荧光PI (3, 4) P2，连同重组SYNJ2及其非荧光底物，PI (3, 4, 5) P3。SYNJ2催化活性的产物置换荧光PI (3, 4) P2，从而降低荧光偏振。
[0158] 根据特定实施方案，使用商业5'PI (3, 4, 5) P3磷酸酶活性荧光偏振测定法（例如， Echelon Bioscience，产品目录号 K-1400) 〇
[0159] 根据特定实施方案，在准备或不准备试验试剂，允许SYNJ2催化活性（脱磷酸） 的条件下温育包含SYNJ2和作为底物的PI (3, 4, 5)P3的反应混合物。例如，试验试剂可为 小分子、核酸分子、肽、抗体、碳水化合物或其组合。温育后，将含PI (3, 4)P2产物的溶液与 PI (3, 4)P2结合蛋白（例如，Tappl的PH-结构域，SEQ ID NO: 15)和荧光PI (3, 4)P2的混 合物混合并测量荧光偏振。该测定法中测得的偏振值在由通过SYNJ2酶活性生成的未标记 PI (3, 4) P2置换结合的荧光PI (3, 4) P2分子时减小并且未结合荧光PI (3, 4) P2分子的量增 加。在试验试剂的存在下荧光偏振值与试验试剂不存在时的值相比增大的情况下，试验试 剂为推定SYNJ2抑制剂。
[0160] 一经鉴定，就使用如以下进一步举例说明的相关测定法，例如明胶酶谱测定法、 transwell测定法和试验动物进一步证实试验试剂作为抗转移药物的功能性。
[0161] 使用这种方法，本发明人已经根据本发明的一些实施方案鉴定了许多可用作 SYNJ2抑制剂的小分子。图19中描绘了这些分子并于下文，实施例10的表2中示出。
[0162] 正如提到的那样，除与癌症发作或进展相关的细胞表面受体的抑制剂外，还施用 SYNJ2抑制剂。根据本发明的一个实施方案，受体为致癌基因。
[0163] 可根据本发明靶向的受体的实例为受体酪氨酸激酶，例如EGFR、TOGFR、VEGFR、 FGFR 和 ErbB-2。
[0164] 可靶向的其它表面分子包括整联蛋白基质金属蛋白酶（MMP)、发动蛋白、TKS5和 CD44〇
[0165] 细胞表面分子的抑制剂在本领域众所周知。下文提供了此类抑制剂的非限制性列 表。
[0166] 因此例如，鉴定EGFR为致癌基因已导致针对EGFR的抗癌疗法的发展。
[0167] 西妥昔单抗（cetuximab)和帕尼单抗（panitumumab)是单克隆抗体抑制剂的实 例。临床研宄的其它单克隆抗体为扎鲁木单抗（zalutumumab)、尼妥珠单抗（nimotuzumab) 和马妥珠单抗（matuzumab)。单克隆抗体阻滞细胞外配体结合结构域。阻滞结合位点后，信 号分子再也无法附着于此和激活酪氨酸激酶。
[0168] 另一种方法是使用小分子抑制在受体胞质一侧的EGFR酪氨酸激酶。没有激酶 活性，EGFR自身无法活化，这是下游衔接蛋白结合的先决条件。表面上通过中断依赖于该 途径生长的细胞内的信号级联，减少肿瘤增殖和迀移。吉非替尼（gefitinib)、埃罗替尼 (erlotinib)和拉帕替尼（Iapatinib)(混合的EGFR和ERBB2抑制剂）是小分子激酶抑制 剂的实例。其它实例包括直接靶向EGFR的易瑞沙（Iressa)和特罗凯（Tarceva)。
[0169] HER2是单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab)(作为Herceptin在市场上出售） 的靶标。曲妥珠单抗仅在HER2过表达的癌症中有效。另一种抑制HER2和HER3受体二聚 化的单克隆抗体，帕妥株单抗（Pertuzumab)，于2012年6月经FDA批准与曲妥珠单抗组合 使用。
[0170] 另外，NeuVax (Galena Biopharma)是指示"杀伤" T细胞革E向并破坏表达HER2的 癌细胞的肽基免疫疗法。
[0171] 通过雌激素受体发信号调节HER2的表达。通过雌激素受体作用的雌二醇 (estradiol)和它莫西芬（tamoxifen)下调HER2的表达。
[0172] 下面列出了可根据本发明使用的抗体的实例而决非意在为限制性。
[0173] 表 1
[0174]
【主权项】
1. 一种预防肿瘤转移的方法，条件是所述肿瘤不是神经胶质瘤，所述方法包括向有需 要的受试者施用治疗有效量的突触囊泡磷酸酶2 (SYNJ2)抑制剂，从而预防肿瘤转移。
2. -种用于预防肿瘤转移的突触囊泡磷酸酶2 (SYNJ2)抑制剂，条件是所述肿瘤不是 神经胶质瘤。
3. -种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的突触囊泡 磷酸酶2 (SYNJ2)抑制剂和与癌症发作或进展相关的细胞表面受体的抑制剂，从而治疗癌 症。
4. 一种突触囊泡磷酸酶2 (SYNJ2)抑制剂和一种与癌症发作或进展相关的细胞表面受 体的抑制剂，用于治疗癌症。
5. 根据权利要求3所述的方法，其中所述的与癌症发作或进展相关的细胞表面受体为 受体酪氨酸激酶。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述受体酪氨酸激酶为ErbB受体。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述ErbB受体为表皮生长因子受体（EGFR)。
8. -种肿瘤转移的推定抑制剂的鉴定方法，所述方法包括在试验试剂的存在下分 析SYNJ2介导的PI(3, 4, 5外3向PI(3, 4)P2的变化，其中在所述试验试剂的所述存在下 PI(3, 4, 5) ?3向PI(3, 4)P2的变化与所述试验试剂不存在时相比的减少是肿瘤转移的推定 抑制剂的指不。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述分析SYNJ2介导的PI(3, 4, 5)P3向PI(3, 4)P2 的变化通过竞争测定法进行。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述竞争测定法由包含与PI(3, 4)P2结合的所述 PI(3, 4)P2结合结构域的复合物来测定PI(3, 4)P2结合结构域的位移。
11. 根据权利要求9-10中任一项所述的方法，其中所述竞争测定法为荧光偏振竞争测 定法。
12. -种在有需要的受试者中癌症预后的方法，所述方法包括测定受试者癌细胞中 SYNJ2的水平或活性，其中，与在未受影响的对照样品的细胞中相比，在所述受试者癌细胞 中所述SYNJ2的所述活性水平的上调是预后不良的指示。
13. 根据权利要求12所述的方法，还包括使用金标法增进所述预后。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述金标法包括标记的检测。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述标记选自由HER-2和雌激素受体（ER)所组 成的组。
16. 根据权利要求1或12所述的方法，其中所述转移为EGF依赖型。
17. 根据权利要求3或12所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
18. 根据权利要求1或3所述的方法，其中所述SYNJ2抑制剂选自由小分子、抗体、肽和 核酸沉默剂所组成的组。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述小分子选自表2中所列的分子。
20. -种用于治疗癌症或预防癌转移的制品，其包括包装材料，所述包装材料包装有 SYNJ2抑制剂和与癌症发作或进展相关的细胞表面受体的抑制剂。
21. 根据权利要求3所述的方法或根据权利要求20所述的制品，其中所述的与癌症发 作或进展相关的细胞表面受体的抑制剂为抗体。
【专利摘要】提供了一种预防肿瘤转移的方法，条件是所述肿瘤不是神经胶质瘤。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的突触囊泡磷酸酶2(SYNJ2)抑制剂，从而预防肿瘤转移。同样，提供了一种治疗癌症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的突触囊泡磷酸酶2(SYNJ2)抑制剂和与癌症发作或进展相关的细胞表面受体的抑制剂，从而治疗癌症。
【IPC分类】A61K31-353, A61P35-04, A61K31-7048, A61K45-06, A61K39-395, A61P35-00
【公开号】CN104822390
【申请号】CN201380062068
【发明人】优素福·亚登, 尼尔·本切特里特
【申请人】耶达研究及发展有限公司
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2013年11月28日
【公告号】CA2877847A1, EP2925359A2, WO2014083567A2, WO2014083567A3, WO2014083567A8