A介导细胞GAPDH mRNA减少约90% 并且完全去除了蛋白质含量（wwwdotambiondotcom/techlib/tn/91/912dothtml)，对准非 翻译区的siRNA也可能有效。
[0110] 第二，使用任何序列比对软件，例如可从NCBI服务器 (wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)获得的BLAST软件，将潜在革E位点与适当的基 因组数据库（例如，人、小鼠、大鼠等）作比较。筛选出表现出与其它编码序列的显著同源 性的推定靶位点。
[0111] 选择合格祀序列作为SiRNA合成的模板。优选的序列是包括低G/C含量的序列， 因为已经证实与G/C含量高于55%的序列相比，其介导基因沉默更有效。沿着靶基因的长 度优选几个靶位点做评价。为了更好地评价所选siRNA，优选一起使用阴性对照。阴性对照 SiRNA优选包括与SiRNA相同的核苷酸组成，但是与基因组没有显著同源性。因此，优选使 用SiRNA的乱序核苷酸序列，条件是其未显示出与其它任何基因的任何显著同源性。
[0112] 应认识到，本发明一些实施方案的RNA沉默剂无需限制为仅含RNA的那些分子，但 是进一步涵盖经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
[0113] 在一些实施方案中，本文提供的RNA沉默剂可与细胞穿透肽在功能上相关。如本 文所使用，"细胞穿透肽"是包含赋予与跨细胞质和/或细胞核膜运输膜渗透性复合物相关 的非能量依赖性（即，非胞吞）易位性质的短（约12-30个残基）氨基酸序列或功能基序。 在本发明一些实施方案的膜渗透性复合物中使用的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能 性半胱氨酸残基，其游离或经衍生化与为这样连接已经修饰的双链核糖核酸形成二硫键。 在美国专利第6, 348, 185号中列出了赋予此类性质的代表性氨基酸基序，其内容明确地以 引用的方式并入本文。本发明一些实施方案的细胞穿透肽优选包括但不限于penetratin、 transportan、plsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS 和 MAP。
[0114] 要使用RNA沉默剂靶向的mRNA包括但不限于其表达与不良表型性状相关的mRNA。 可能靶向的示例性mRNA是编码截短蛋白，即包含缺失的mRNA。相应地，本发明一些实施方 案的RNA沉默剂可靶向所述缺失任一侧的桥接区。向细胞中引入此类RNA沉默剂会引起突 变蛋白下调，同时使非突变蛋白不受影响。
[0115] 根据另一实施方案，RNA沉默剂可为miRNA。
[0116] 术语"微RNA"、"miRNA"和"miR"同义并且指长度约19-28个核苷酸，调苄基因表 达的非编码单链RNA分子的总称。在各种生物（virusesdotfwdarwdothumans)中发现miRNA 并且已经证实在发育、体内稳态和疾病病因学上起作用。
[0117] 下面是对miRNA活性机制的简单描述。
[0118] 编码miRNA的基因转录，导致称为pri-miRNA的miRNA前体生成。pri-miRNA通常 是包含多个pri-miRNA的多顺反子RNA的一部分。pri-miRNA可与莖和环形成发夹。莖可 能包含错配碱基。
[0119] pri-miRNA的发夹结构由为RNA酶III核酸内切酶的Drosha识别。Drosha通常识 别pri-miRNA中的末端环并且将约两个螺旋转角裂解成茎以生成称为pre-miRNA的60-70 个核苷酸的前体。Drosha以RNA酶III核酸内切酶典型的交错切口裂解pre-miRNA，产生 带5'磷酸和~2个核苷酸的3'突出的pre-miRNA茎环。据估计茎（~10个核苷酸）伸 出Drosha裂解位点的约一个螺旋转角对有效加工必不可少。然后pre-miRNA通过Ran-GTP 和输出受体输出蛋白-5从细胞核主动运输到细胞质。
[0120] 然后pre-miRNA的双链茎由也是RNA酶III核酸内切酶的Dicer识别。Dicer也 可识别在茎环基部的5'磷酸和3'突出。然后Dicer裂解掉末端环，两个螺旋转角离开茎 环基部，留下另外的5'磷酸和~2个核苷酸的3'突出。所生成的可能包含错配的siRNA 样双链体包含成熟miRNA和称为miRNA*的相似大小的片段。miRNA和miRNA*可能源自 pri-miRNA和pre-miRNA的相对臂。可在克隆miRNA库中找到miRNA*序列，但是通常频率 比miRNA低。
[0121] 虽然最初与miRNA* -起作为双链物种存在，但是miRNA最终作为单链RNA并入称 为RNA诱导沉默复合物（RISC)的核糖核蛋白复合物中。各种蛋白质均可形成RISC，这样可 在对miRNA/miRNA*双链体的特异性、靶基因结合位点、miRNA活性（阻遏或激活）和miRNA/ miRNA*双链体的哪一条链载入RISC的方面导致可变性。
[0122] 当miRNA:miRNA*双链体的miRNA链载入RISC时，去除并降解miRNA*。 miRNA:miRNA*双链体中载入RISC的链是其5'末端配对不太牢固的链。在miRNA:miRNA* 的两端具有大致相当的5'配对的情况下，miRNA和miRNA*可能都具有基因沉默活性。
[0123] RISC基于miRNA和mRNA之间的高互补性水平，特别是通过miRNA的核苷酸2-7识 别靶核酸。
[0124] 许多研宄已着眼于为实现翻译的有效抑制，miRNA及其mRNA靶标之间的碱基配对 要求（经Bartel 2004年审核，Cell 116-281)。在哺乳动物细胞中，miRNA的前8个核苷 酸可能很重要（Doench&Sharp 2004GenesDev 2004-504)。然而，微RNA的其它部分也可能 参与mRNA结合。而且，3'处足够的碱基配对可补偿5'处的配对不足（Brennecke等，2005 PLoS 3-e85)。分析全基因组上miRNA结合的计算研宄已经表明在革El标结合中对miRNA的 5'处的碱基2-7的特定作用，但是也公认了通常发现为"A"的第一个核苷酸的作用（Lewis 等2005 Cell 120-15)。类似地，Krek等使用核苷酸1-7或2-8鉴定和验证靶标（2005, Nat Genet 37-495)〇
[0125] mRNA中的靶位点可能在5'UTR、3'UTR或编码区内。有趣的是，多个miRNA可通过 识别相同或多个位点调节相同mRNA靶标。大多数基因识别靶标中多个miRNA结合位点的 存在可能表明多个RISC的协同作用提供了最有效的翻译抑制。
[0126] miRNA可指示RISC通过两种机制中的任一种下调基因表达：mRNA裂解或翻译阻 遏。如果mRNA与miRNA有一定程度的互补性，则miRNA可指定mRNA的裂解。当miRNA指 导裂解时，切口通常介于与miRNA的残基10和11的核苷酸配对之间。可选地，如果miRNA 与miRNA没有必要程度的互补性，则miRNA可阻遏翻译。翻译阻遏可能在动物中更普遍，因 为动物可能在miRNA和结合位点之间具有更低程度的互补性。
[0127] 应该注意的是，在任一对miRNA和miRNA*的5'和3'末端可能存在可变性。这种 可变性可能是由于Drosha和Dicer对于裂解位点酶促加工的可变性。miRNA和miRNA*的 5'和3'末端的可变性也可能是由于pri-miRNA和pre-miRNA莖结构中的错配。莖链的错 配可能产生一群不同的发夹结构。莖结构的可变性也可能导致Drosha和Dicer裂解产物 的可变性。
[0128] 术语"微RNA模拟物"指能够进入RNAi途径并调苄基因表达的合成非编码RNA。 miRNA模拟物模仿内源微RNA(miRNA)的功能并且可设计成成熟、双链分子或模拟物前体 (例如，pre-miRNA)。miRNA模拟物可由经修饰或未经修饰的RNA、DNA、RNA-DNA杂交体或 替代核酸化学物质（例如，LNA或2'-0, 4'-C-乙烯-桥接核酸（ENA))构成。对于成熟、 双链miRNA模拟物而言，双链体区的长度可在13-33、18-24或21-23个核苷酸之间变化。 miRNA 也可包含总计至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个核苷酸。miRNA 的序列也可能 是pre-miRNA的前13-33个核苷酸。miRNA的序列也可能是pre-miRNA的后13-33个核苷 酸。
[0129] 从上文提供的描述应认识到，可按许多方式实现癌细胞与miRNA接触：
[0130] 1.用成熟双链miRNA瞬时转染癌细胞。
[0131] 2.用编码成熟miRNA的表达载体稳定或瞬时转染癌细胞。
[0132] 3.用编码pre-miRNA的表达载体稳定或瞬时转染癌细胞。pre-miRNA序列可能 包含45-90、60-80或60-70个核苷酸。pre-miRNA序列可能包含如本文所述的miRNA和 miRNA*。pre-miRNA序列也可能是从pri-miRNA的5'和3'末端排除0-160个核苷酸的 pri-miRNA 序列。
[0133] 4.用编码pri-miRNA的表达载体稳定或瞬时转染癌细胞。pri-miRNA序列可能包 含 45-30, 000、50-25, 000、100-20, 000、1，000-1，500 或 80-100 个核苷酸。pri-miRNA 序列 可能包含如本文所述的pre-miRNA、miRNA和miRNA*及其变体。
[0134] 能够下调SYNJ2另一种试剂是能够特异性裂解SYNJ2的mRNA转录产物或DNA序 列的DNA酶分子。DNA酶是能够裂解单链和双链靶序列的单链多聚核苷酸（Breaker，R. R.和 Joyce, G. Chemistry and Biology 1995 ;2:655 ;Santoro，S.W.&Joyce，G.F. Proc. Natl, Acad Sci. USA 1997 ;943:4262)。已经提出了 DNA 酶的一般模型（"10-23" 模 型）。"10-23"DNA酶具有一个15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其侧面是两个各 7-9个脱氧核糖核苷酸的底物识别结构域。这类DNA酶可在嘌呤：嘧啶接点处有效裂解 其底物（Santoro, S. W. &Joyce, G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199 ;对 DNA 酶的评论，见 Khachigian，LM[Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002)]。
[0135] 在Joyce等的美国专利第6, 326, 174号中已经公开了构建和扩增识别单链和双 链靶裂解位点的合成、工程化DNA酶的实例。最近观察到针对人尿激酶受体的类似设计的 DNA酶抑制尿激酶受体表达，并且成功抑制体内结肠癌细胞转移（Itoh等，20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther wwwdotasgtdotorg)。在另一种应用中，与 bcr-abl 致 癌基因互补的DNA酶在白血病细胞中成功抑制致癌基因表达，并且在CML和ALL的情况下 减小了在自身骨髓移植中的复发率。
[0136] 也可使用能够与编码SYNJ2的mRNA转录产物特异性杂交的反义多聚核苷酸实现 SYNJ2的下调。
[0137] 必须在考虑对反义方法重要的两个方面的同时实现可用于有效下调SYNJ2的反 义分子的设计。第一方面是寡核苷酸向适当细胞的细胞质的递送，而第二方面是以抑制其 翻译的方式特异性结合细胞内指定mRNA的寡核苷酸的设计。
[0138] 现有技术传授了许多可用于有效地将寡核苷酸递送到各种细胞类型的递送策 略[见，例如，Luft J Mol Med 76:75-6(1998) ;Kronenwett 等 Blood 91:852-62(1998); Rajur 等 Bioconjug Chem 8:935-40 (1997) ;Lavigne 等 Biochem Biophys Res Commun 237:566-71(1997)和 Aoki 等（1997)Biochem Biophys Res Commun 231:540-5(1997)]。
[0139] 另外，根据说明靶mRNA和寡核苷酸中结构改变的能量学的热力学循环，鉴定对 其革El mRNA的预测结合亲和力最高的序列的算法也可用[见，例如，Walton等Biotechnol Bioeng 65:1-9(1999)]。
[0140] 此类算法已经成功用于在细胞中实现反义方法。例如，Walton等研发的算法使得 科学家们能够成功设计兔珠蛋白（RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-a (TNFa)转录产物的 反义寡核苷酸。同一研宄小组新近已报道，通过动力学PCR技术评估，在细胞培养物中对三 种模型靶mRNA (人乳酸脱氢酶A和B和兔gpl30)合理选择的寡核苷酸的反义活性证明在 几乎所有情况下，包括在具有磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化学性质的两种细胞类型中 对三种不同靶标的试验中有效。
[0141] 另外，还公开了使用体外系统设计和预测特定寡核苷酸的效率的几种方法 (Matveeva 等，Nature Biotechnology 16:1374-1375(1998)]。
[0142] 例如，靶向SYNJ2 mRNA(其编码SYNJ2蛋白）的适合反义寡核苷酸将具有以下 序列：CCCTTTGTCTGCCACCTCCT(SEQ ID N0:10)、ACCCATCTTGCTCTCTCCC(SEQ ID N0:11)和 TCTTCCTCCACCACAGCACC(SEQ ID N0:12)。
[0143] 几项临床试验已经证明反义寡核苷酸的安全性、可行性和活性。例如，已经成功使 用了适合治疗癌症的反义寡核苷酸[Holmund等，Curr Opin Mol Ther