一种提取花生壳总黄酮的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及提取花生壳总黄酮的工艺。
【背景技术】
[0002] 花生是豆科一年生草本植物，广泛种植在世界各地。我国是花生生产大国，年产 量达到1500万吨以上；同时也是世界上农业废弃物产出量最大的国家，每年农业生产废弃 物产量约为6. 5亿吨。农业废弃物综合利用问题，是世界各国普遍需要解决的课题。特别 是随着自然资源日趋短缺和废弃物数量剧增，农业废弃物越来越受到人们重视。农业废弃 物综合利用问题，是世界各国普遍需要解决的课题。特别是随着自然资源日趋短缺和废弃 物数量剧增，农业废弃物越来越受到人们的重视。农业废弃物资源化已成为农业循环经济 的重要内容，是改善农业生态环境的必然要求，是节约型社会的一个具体体现。对于缓解资 源不足，减少环境污染，拓展农业外部功能，提高农业综合效益，都具有重要的意义。花生壳 就是农产品加工废弃物的一种。我国年副产花生壳近4000千吨，占花生果重的30%左右。 这些花生壳除了少部分被利用做饲料和燃料外，大部分被废弃掉，造成了资源极大浪费。据 有关资料报道，花生壳中粗蛋白含量4. 8% -7. 2%，粗脂肪含量1. 2% -2. 8%，无氮浸出物 10. 6% -21. 1%，粗纤维65. 7% -70. 3%。此外，还含有钙、磷、镁、钾、铁、锰、锌、铜等矿物 质。作为药用成分，主要是黄酮类化合物，其中木犀草素是有效成分，此外还含有谷甾 醇-D-葡萄糖苷、皂苷等。因此，为花生壳找合理的应用途径，提高其利用价值具有重要意 义。
[0003] 心血管疾病是目前危害人类健康的第一杀手，以木庫草素为代表的花生壳中黄酮 类成分被认为能降低血压、改善高血脂症状，美国已开发了花生壳提取物用于降低高血压、 高血脂的药物；日本有关食品研宄部门也在进行花生壳提取物的药学研宄，这类由花生壳 提取物开发的药品将很快进入临床。此外，黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛低存在 于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复 杂多样，表现多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病，具有抗炎抑 菌、降血糖，抗氧化，抗辐射、抗癌、抗肿瘤及增强免疫力等药理作用。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术不利于工业化生产的缺陷，本发明公开了一种节约成本，操作 简单的提取花生壳总黄酮的工艺，该工艺采用大孔吸附树脂富集药材中有效成分，再结合 其他方法进行定性鉴定和含量测定，得到了总黄酮含量较高的产物，为制剂研宄打下良好 基础。
[0005] 本发明的花生壳总黄酮的提取方法，包括以下步骤：
[0006] 1)取适量药材，进行粉碎，置于圆底烧瓶中，加入10倍量浓度为70%的乙醇溶液， 浸泡24h，回流提取3次，每次2h。合并提取液，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏；
[0007] 2)将花生壳粗提取物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶 中；
[0008] 3)加入等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置12h，转移石油醚层，并加入 等体积石油醚，直至石油醚层无色；
[0009] 4)向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，静置 12h；
[0010] 5)采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得到花生壳总黄 酮粉末，重复上述操作，直至乙酸乙酯层无色；
[0011] 6)大孔吸附树脂精制，条件如下：树脂柱：(65. 5cm*100cm;吸附条件：上柱液总黄 酮含量I. 4mg/ml;上柱液pH6. 5 ;上柱液体积约1600mL;上柱流速lBV/h;采用2次上样法； 洗脱条件：先用水洗至流出液无色；洗脱剂60%乙醇；洗脱剂流速3BV/h;洗脱体积：开始 时，洗脱液颜色为棕黄色，之后颜色变浅直至恒定，此时停止收集。
[0012] 本发明的有益效果为：提取精制工艺操作简单且结果稳定可靠，所需试剂器材均 可重复利用，工业能耗极低，原料成本低廉，非常适合大规模的工业化生产。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明进一步解释说明。
[0014] 实施例1
[0015] 提取方法的考察如下：将花生壳适当粉碎，称取l〇g，置于圆底烧瓶中，加入10倍 量浓度为70%乙醇，分别采用超声提取法和回流提取法，每种方法提取3次，每次lh。过滤， 精密吸取0. 4mL滤液置于IOmL量瓶中，加入2mL5%的AlCl3溶液，再加入lmol/LCH3C00K 溶液3. 2mL，最后用甲醇溶解并定容至刻度。按照紫外分光光度法在200-600nm波长范围内 进行扫描。按照标准曲线方程A= 0. 0894C-0. 022,r= 0. 9998计算出总黄酮含量。以总 黄酮提取率（提取物总黄酮含量/药材量）和转移率（提取物总黄酮含量/药材中总黄酮 含量*100% )为指标来评价提取方法优劣。结果见表1。
[0016] 表1总黄酮提取方法的考察
[0017]
[0018] 由上表可知，回流提取法和超声提取法所得总黄酮提取率和转移率相近，考虑到 工业生产，故本文最终选用回流提取法。
[0019] 实施例2
[0020] 本文采用乙醇作为提取溶剂来提起花生壳总黄酮，及保证了总黄酮含量，又减少 了有机溶剂污染。
[0021] 实施例3
[0022] 乙醇浓度的考察如下：将花生壳适当粉碎，称取10g，置于圆底烧瓶中，加入10倍 量浓度为O%、10 %、30 %、50 %、70 %、90 %乙醇溶液，回流提取2h，过滤，将滤液按照实施 例1中方法测定吸光度。再按照实施例1中的标准曲线计算出总黄酮含量。以总黄酮提取 率和转移率为指标来选择乙醇的最优浓度。结果见表2
[0023] 表2在不同乙醇浓度下总黄酮的提取率和转移率的比较
[0024]
[0025] 由上表可知，当采用浓度为70%乙醇回流提取时，提取率和转移率最高。因此选择 70%乙醇为提取溶剂。
[0026] 实施例4
[0027] 正交试验对提取工艺的优化如下：取花生壳9份，选择溶剂用量（A)、提取次数 (B)、提取时间（C)及浸泡时间（D)作为考察对象，以总黄酮提取率为指标，选用L9(34)正 交表进行试验。因素水平设计及结果见表3和表4
[0028] 表3因素水平设计正交试验设计
[0029]
[0032] 由上表可知，直观分析结果表明各因素对总黄酮提取率影响大小顺序为：A>D> C>B，最优组合为A3B3C2D1，考虑到因素D对总黄酮提取率影响较大，而因素B影响较小，故 综合考虑，确定最佳提取物工艺为A3B2C2D3,即药材浸泡24h，10倍量浓度为70%乙醇，提取 3次，每次2h。
[0033] 实施例5
[0034] 最佳提取工艺重现性试验如下：按正交试验确定的提取工艺，取花生壳3份，适当 粉碎，每份称取l〇〇g，置于圆底烧瓶中，加入10倍量浓度70%乙醇溶液，浸泡24h，回流提 取3次，每次2h。合并提取液，回收乙醇，蒸干残余提取溶剂，得浸膏。按实施例1中的方 法测定吸光度，再按实施例1中的标准曲线方程总黄酮含量。在以下色谱条件下，测定木 犀草素含量：色谱柱：大连江申C18-BDS柱（5ym，200mm*4. 6mm);流动相：甲醇：0. 2%磷酸 (51 ::49);流速：lmL/min;检查波长：350nm;柱温：室温；进样量：20yL。以总黄酮提取率 和转移率为目标，考察工艺重现性。并记录膏量，出膏率。结果见表5。
[0035] 表5精制结果
[0036]
[0038] 由上表可知，提取工艺重现性良好。且粗提取物中总黄酮含量约为7. 8%，木犀草 素含量为3. 7%。
[0039] 实施例6
[0040] 采用石油醚对花生壳总黄酮粗提取物萃取，意在除去提取物中小极性杂质。具体 操作方法如下：将花生壳粗提物浸膏加入适量的水，用玻璃棒搅拌至混悬，转移至萃取瓶 中；加入等体积石油醚，盖上瓶塞，轻轻震荡数次，精制12h，转移石油醚层，并重新加入等 体积石油醚，重复上述操作，直至石油醚层无色。回收石油醚，将水层保留待用。最终试验 共萃取3次后，石油醚层无色。
[0041] 实施例7
[0042] 将石油醚萃取后的水层溶液用乙酸乙酯进行萃取，意在萃取水层中的黄酮类物 质，具体方法如下：向石油醚萃取后的水层加入等体积乙酸乙酯，盖上瓶塞，轻轻震荡数次， 静置12h，采用旋转蒸发仪回收乙酸乙酯，并将得到的萃取物水浴蒸干，得花生壳总黄酮粉 末。重复上述操作，直至乙酸乙酯层无色。最终试验共萃取5次后，乙酸乙酯层无色。合并 萃取物，称重，按照实施例1和实施例5中的方法分别测定萃取物中总黄酮含量和木犀草素 含量，并计算转移率。