（CT η = 4, HF η = 6, HF-Akk和HF-K-Akk η = 5)。（G)用于粘液层厚度测量的代表性的阿辛蓝图像，柱条= 40 μπι。M=粘膜，頂=内粘液层。数据显示为平均值土s.e.m。根据事后ANOVA单因素统 计分析，具有不同上标字母的数据显著不同（P〈〇. 05)。
[0129] 图9是显示热灭活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌在服用HF饮食的小鼠中不降低皮下、肠 系膜和附睾的脂肪量并且不增加结肠抗微生物肽的直方图的组合。（A)在喂养对照（CT)或 HF饮食（HF)并且用含有无菌无氧PBS和甘油的每日经口管饲物每日治疗、持续4周的对照 小鼠中测量的皮下、肠系膜和附睾的脂肪库重量（g/l〇〇g体重）。经治疗小鼠接受经口管饲 活的嗜粘蛋白阿克曼氏菌（HF-Akk)或死的嗜粘蛋白阿克曼氏菌（HF-K-Akk) (2. IO8个细菌 细胞悬浮于200 μ 1无菌无氧PBS中）并且被喂养HF饮食（η = 8)。（B)结肠再生胰岛衍 生3-γ (RegIII γ，由Reg3g编码）mRNA表达的mRNA表达（η = 8-18)，数据代表来自两次 嗜粘蛋白阿克曼氏菌研宄的结果。数据显示为平均值土s.e.m。根据事后ANOVA单因素统 计分析，具有不同上标字母的数据显著不同（P〈〇. 05)。
[0130] 图10是显示在8周期间每周用嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗3次的效率的直方图的 组合。（A)在喂养对照饮食（CT) (η = 8)或HF饮食（HF) (η = 10)并且通过每周三次经口 管饲含有甘油的无菌无氧PBS或嗜粘蛋白阿克曼氏菌（HF-Akk) (η = 10)治疗8周的对照 小鼠中测量的体重（g)。（2. IO8个细菌细胞悬浮于200 μ 1无菌无氧PBS中）。（B)皮下脂 肪量。（C)内脏脂肪组织（肠系膜和附睾）。数据显示为平均值土s.e.m。根据事后ANOVA 单因素统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同（P〈〇. 05)。
[0131] 图11是显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌降低喂养高脂饮食的小鼠中的血浆胆固醇的直 方图。（CT)喂养对照饮食的小鼠；(Akk)通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌（2. IO8个 细菌细胞悬浮于200 μ 1无菌无氧磷酸盐缓冲液（PBS)中）治疗并且喂养对照饮食的小鼠； (HF)喂养高脂饮食的小鼠；(HF-Akk)通过每日经口管饲嗜粘蛋白阿克曼氏菌（IO 9个细菌 细胞悬浮于200 μ 1无菌无氧磷酸盐缓冲液（PBS)中）治疗并且喂养HF-饮食的小鼠。
[0132] 图12是显示植物乳杆菌WCFSl在饮食诱导的肥胖症小鼠中不降低脂肪量并且不 改善脂肪组织代谢和肠道屏障功能的直方图的组合。对照小鼠被喂养对照饮食（CT)或HF 饮食（HF)并且用含有无菌无氧PBS和甘油的每日经口管饲物治疗4周。经治疗小鼠接受经 口管饲植物乳杆菌WCFSl (HF-LP) (2. IO8个细菌细胞悬浮于200 μ L无菌无氧PBS中）并且 被喂养HF饮食（η = 7-8)。（A)通过时域NMR测量的最终脂肪量（η = 7-8)。皮下、肠系膜 和附睾的脂肪库重量（g/l〇〇g体重Mn = 7-8)。（B)在内脏脂肪库（肠系膜脂肪）中测量 脂肪细胞分化（Cebpa)、脂肪生成（Accl ;Fasn)和脂质氧化（Cptl ;Acoxl ;Pgcla ;和Ppara) 的标记物的mRNA表达（η = 7-8)。（C)在阿辛蓝染色后通过组织学分析测量的粘液层的厚 度（η = 4-6)。（D)门静脉血清LPS水平（η = 6-7)。（E)结肠 RegIII γ (由Reg3g编码） mRNA表达的mRNA表达（η = 8-18)。数据显示为平均值土 s. e. m。根据事后ANOVA单因素 统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同（P〈〇. 05)。
[0133] 实施例
[0134] 通过以下实施例进一步说明本发明。
[0135] 材料和方法
[0136] 小鼠
[0137] ob/ob实验：ob/ob相对于瘦的研宄：将6周龄ob/ob(n = 5只/组）小鼠（C57BL/6 背景，Jackson-Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)以每笼2只或3只小鼠为一组圈养在受 控环境（12-h日光周期，于6-pm关灯）中，并且可自由获取食物和水。对小鼠喂养对照饮 食（A04, Villemoisson-sur-Orge, France) 16周。收获盲肠内容物，将其浸入液氮中，并且 储存在-80°C，用于进一步嗜粘蛋白阿克曼氏菌分析。
[0138] ob/ob益生元研宄：将6周龄ob/ob (n = 10只/组）小鼠（C57BL/6背景， Jackson-Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)以每笼2只小鼠为一组圈养在受控环境 (12-h日光周期，于6-pm关灯）中，并且可自由获取食物和水。如先前所述，对小鼠喂 养对照饮食（Ob-CT) (A04, Villemoisson-sur-Orge, France)或补充有益生元（例如 低聚果糖）的对照饮食（Ob-Pre) (Orafti, Tienen, Belgium)，持续 5 周（Everard 等 Diabetes 60,2775-2786(2011))。该组小鼠先前已在 Everard 等（Everard 等 Diabetes 60,2775-2786(2011))中得到表征。
[0139] 高脂益生元实验：将一组10周龄C57BL/6J小鼠（40只小鼠 ，η = 10只/组） (Charles River, Brussels, Belgium)以每笼5只小鼠为一组圈养，并且可自由获取食物和 水。对小鼠喂养对照饮食（CT) (A04, Villemoisson-sur-Orge, France)、或对照饮食并且用 在自来水中添加的益生元（例如低聚果糖（〇rafti, Tienen, Belgium) (0. 3g/小鼠/日）） 治疗（CT-Pre)、或高脂饮食（HF) (60%脂肪和20%碳水化合物（千卡/100g)，D12492,研宄 饮食，New Brunswick，NJ，USA)、或HF饮食并且用在自来水中添加的低聚果糖（0. 3g/小鼠 /日）治疗（HF-Pre)。治疗持续8周。
[0140] HFD嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗：将一组10周龄C57BL/6J小鼠（40只小鼠 ，η = 10只/组）（Charles River, Brussels, Belgium)以每笼2只小鼠为一组圈养，并且可自由 获取食物和水。对小鼠喂养对照饮食（CT) (AIN93Mi ;研宄饮食，New Brunswick, NJ，USA) 或高脂肪饮食（HF) (60 %脂肪和20 %碳水化合物（千卡/100g)，D12492,研宄饮食，New Brunswick, NJ, USA)。通过经口管饲2. 108cfu/0. 2ml的剂量口服施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌 (悬浮于无菌无氧磷酸盐缓冲液中）来治疗小鼠（CT-Akk和HF-Akk)，并且通过经口管饲等 体积的无菌无氧磷酸盐缓冲液治疗对照组（CT和HF)。治疗持续4周。
[0141] 如先前所述使嗜粘蛋白阿克曼氏菌Muct(ATTC BAA-835)厌氧生长在基于粘蛋白 的基础培养基中（Derrien 等 Int J Syst Evol Microbiol 54, 1469-1476 (2004))，然后进 行洗涤并且悬浮于无氧磷酸盐缓冲液（包含25% (v/v)甘油）中，直到I. KTcfu/ml的最 终浓度。
[0142] HFD活嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗相对于热杀死的嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗和植物 乳杆菌WCFSl治疗：将一组10周龄C57BL/6J小鼠（40只小鼠 ，η = 8只/组）（Charles River, Brussels, Belgium)以每笼2只小鼠为一组圈养，并且可自由获取食物和水。对小鼠 喂养对照饮食（CT) (AIN93Mi ;研宄饮食，New Brunswick，NJ，USA)或高脂饮食（HF) (60%脂 肪和20%碳水化合物（千卡/100g)，D12492,研宄饮食，New Brunswick，NJ，USA)。每日通 过经口管饲以2. 108Cfu/0. 2ml的剂量口服施用嗜粘蛋白阿克曼氏菌（悬浮于无菌无氧磷 酸盐缓冲液中）来治疗小鼠。通过高压蒸气灭菌（15min，121°C，225kPa)将嗜粘蛋白阿克 曼氏菌热杀死/灭活。通过在含粘蛋白的培养基上培养进行活力检测以确认不存在任何活 细胞。使植物乳杆菌WCFSl厌氧生长在MRS培养基（Difco乳酸杆菌MRS肉汤；BD)中，洗 涤，浓缩，并且以与嗜粘蛋白阿克曼氏菌制备相同的方式处理。通过每日经口管饲等体积的 无菌无氧PBS治疗两个对照组（CT和HF)，持续4周，所述无菌无氧PBS含有与治疗组类似 的终浓度的甘油（2. 5% )(用一滴IOOmM柠檬酸钛还原）。
[0143] 每周一次记录食物和水的摄取。通过使用7. 5MHz时域核磁共振（TD-NMR) (LF50m inispec，Bruker，Rheinstetten，Germany)评价身体组成。
[0144] 所有小鼠实验均经当地伦理委员会（the local ethics committee)批准并且依 照当地伦理委员会的指南进行。圈养条件由2010年4月6日关于实验室动物保护的比利 时法律（协议号LA1230314)详细说明。
[0145] 组织取样
[0146] 动物已在放血和组织取样前用异氟烧（Forene?, Abbott, Queenborough, Kent, E ngland)麻醉，然后通过颈椎脱位将小鼠杀死。将脂肪库（附睾脂肪库、皮下脂肪库和肠系 膜脂肪库）、肝精确地解剖并称量；三种脂肪组织的相加对应于肥胖指数。将肠段（回肠、 盲肠和结肠）、盲肠内容物和脂肪组织浸入液氮中，并且储存在-80°C，用于进一步分析。
[0147] 粘液层厚度
[0148] 立即将近端结肠段移出并且在卡诺伊溶液（Carnoy's solution)(乙醇-乙酸-氯 仿，6/3/lv/v/v)中在4°C固定2小时。然后将样品浸入100%乙醇中24小时，然后处理用 于石蜡包埋。用阿辛蓝将5μπι的石蜡切片染色。每个视野由对实验组不知情（blinded) 的研宄人员垂直于内粘液层进行最少20次不同测量。通过使用图像分析器（Motic-image Plus 2. 0ML, Motic, China)对每个结肠分析5到19个随机选择的视野，总共进行2146次测 量。
[0149] RNA制备和实时qPCR分析
[0150] 使用TriPure试剂（Roche)从组织制备总RNA。通过在Agilent 2100生物分析 器（Agilent RNA 6000 Nano Kit, Agilent)上运行1 μ 1各样品进行总RNA的定量和完整 性分析。
[0151] 通过使用反转录系统试剂盒（Promega, Leiden, The Netherlands)反转录1 μ g 总 RNA 来制备 cDNA。利用 StepOnePlus?实时 PCR 系统和软件（Applied Biosystems，Den I jssel, The Netherlands)使用用于检测的 Mesa Fast qPCR?(Eurogentec，Seraing，Belg ium)根据制造商说明书进行实时PCR。选择RPL19作为管家基因。所有样品均一式两份在 单个96孔反应板中运行，并且根据T act方法分析数据。通过在扩增结束时进行的对熔化曲 线的分析来检查扩增产物的特性和纯度。用于靶定小鼠基因的引物序列呈现于下表1中。
[0152]
[0153] 胰岛素抵抗指数
[0154] 通过将治疗4周（嗜粘蛋白阿克曼氏菌研宄）后进行的口服葡萄糖负荷（2g葡萄 糖/kg体重）后获得的血糖和血浆胰岛素两者的曲线下面积（Omin和15min)相乘来确定 胰岛素抵抗指数。在开始日光周期后两小时后移除食物，并且在6小时禁食期后治疗小鼠， 如先前所述（Everard 等 Diabetes 60,2775-2786(2011))。
[0155] 生物化学分析
[0156] 通过使用基于豐变形细胞溶解物（LAL)动态显色方法的Endosafe-MCS (Charles River Laboratories, Lyon, France)测量门静脉血LPS浓度，所述动态显色方法测量与样 品中的内毒素浓度直接相关的色彩强度。用无内毒素的缓冲液将血清1/10稀释以将反应 中的干扰（抑制或增强）最小化并且在70°C加热15min。用无内毒素的LAL试剂水（Charles River Laboratories)将每个样品以1/70或1/100稀释并且以一式两份处理且在确定中 包括用于每个样品的两种掺料（spike)。所有样品均已验证回收和系数变异。检测下限是 0· 005EU/ml。使用 ELISA 试剂盒（Mercodia, Upssala, Sweden)根据制造商说明书在 25 μ 1 血浆中确定血浆胰岛素浓度。
[0157] 使用 ELISA 试剂盒（Ε99-103, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)确定奠便 IgA水平。将新收集的粪便在-80°C冷冻，然后在50mM Tris(pH 7. 4)、0. 14M NaCl、l%牛 血清白蛋白、0.05% Tween 20中稀释。使用1/250稀释度通过ELISA依照制造商说明书来 测量IgA。
[0158] 从小鼠盲肠样品分离DNA
[0159] 将死后收集的小鼠盲肠内容物储存在_80°C。使用QIAamp-DNA粪便小提试剂盒 (Qiagen, Hilden, Germany)根据制造商说明书从盲肠内容物提取宏基因组DNA。
[0160] 内源性大麻素肠内水平的测量
[0161] 将回肠组织在CHCl3(IOml)中均浆，并且添加氘化标准物。如先前所述产生提取 和校准曲线（Muccioli等，Mol Syst Biol, 2010, 6, 392)，并且通过组织样品重量将数据归 一化。
[0162] qPCR:引物和条件
[0163] 用于检测嗜粘蛋白阿克曼氏菌的引物和探针基于16S rRNA基因序列：F-嗜 粘蛋白阿克曼氏菌CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT (SEQ ID NO: 29)、R-嗜粘蛋白阿克曼氏菌 CAGCACGTGAAGGTGGGGAC(SEQ ID N0:30)。利用 St印OnePlus?实时PCR系统和软件（Applied Biosystems, Den I jssel, The Netherlands)使用 Mesa Fast qPCR?(Eurogentec, Seraing, Belgium)根据制造商说明书实现检测。在同一轮测定中一式两份进行每一测定。然后将每 个样品的循环阈值与通过稀释基因组DNA(5倍连续稀释）（DSMZ, Braunshweig, Germany)得 到的标准曲线（一式三份进行）进行比较。将数据表示为细菌/g盲肠内容物的对数（Log)。
[0164] MIT芯片：PCR引物和条件
[0165] 使用小鼠肠道芯片（Intestinal Tract Chip) (MIT芯片）分析从盲肠内容物提取 的DNA，所述小鼠肠道芯片是由3, 580个靶向16S rRNA基因的两个超变区（VI区和V6区） 的3, 580个不同寡