也起了重要作用。[Mizushima N, Komatsu M. Autophagy:renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147(4):728-41.]
[0010] 作为程序性细胞死亡的一种，细胞自噬能通过多种途径直接或是间接导致细胞死 亡。[Denton D, Nicolson S, Kumar S. Cell death by autophagy: facts and apparent artefacts. Cell Death Differ. 2012; 19 (I) : 87-95.]细胞在一些特定的条件下，由于一系 列因素的影响导致了各类基因突变从而导致的细胞各类遗传性状及功能改变。这类改变 可能将具有正常功能和特性的细胞转变为具有分裂迅速、抗凋亡等恶性特征的细胞即癌细 胞。研究表明，肿瘤的发生与发展和自噬的关系极为密切。
[0011] 一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞 中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还 是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因 素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSC1和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使 蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞（如肝、胰腺、 乳腺癌等）尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬缺乏 可引起自噬底物P62积聚，通过NF- K B信号途径引起肿瘤形成。
[0012] [Trocoli A, Djavaheri-Mergny M. The comp lex interplay between autophagy andNF-kB signaling pathways in cancer cells. Am J Cancer Res. 2011; I (5) :629-49.]然而在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够 的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以 生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情况下约3h，HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到 37%。这也说明了在营养缺乏等条件下自噬也是肿瘤细胞的一种自我保护的机制。[Baldwin AS. Regulation of cell death and autophagy by IKK andNF-kB: critical mechanisms in immune function and cancer. Immunol Rev. 2012;246(I):327-45.]
[0013] 抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞自噬所体现的作用大致可以概括为两种：大部分情况 下是对肿瘤细胞的保护，某些情况下也能对肿瘤细胞进行杀伤。研究表明化疗药物5-FU 以及单克隆抗体药物曲妥珠单抗（Trastuzumab)和西妥昔单抗（Cetuximab)均能显著地 诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感 性，[① Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C, Menendez JA. Autophagy Facilitates the Development of Breast Cancer Resistance to the Anti_HER2Monoclonal Antibody Trastuzumab. PLoS One. 2009;4(7):e6251;② Li J,Hou N,Faried A,Tsutsumi S,et al. Inhibition of Autophagy by3-MA Enhances the Effect of5-FU_Induced Apoptosis in Colon Cancer Cells. Ann Surg Oncol. 2009; 16 (3) :761 - 771.]经文献检索等，到目前 为止，尚未见有关天冬酰胺酶诱导肿瘤细胞自噬以及细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶联合用 于制备用于增强天冬酰胺酶对肿瘤的治疗效果的药物组合物的报道。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的是提供自噬抑制剂与天冬酰胺酶组合物及其在制备肿瘤增效药物 中的用途
[0015] 本发明的组合药物，其包含一种或多种细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶活性组份， 其特点在于，细胞自噬抑制剂自身无明显细胞毒性但能通过抑制细胞自噬增强天冬酰胺酶 的疗效，从而降低天冬酰胺酶在治疗肿瘤时的用量，减少其潜在的副作用和降低治疗成本。
[0016] 更具体的，本发明中，将一种或多种细胞自噬抑制剂和一种或多种天冬酰胺酶的 活性组份联合用于制备用于增强天冬酰胺酶对肿瘤的治疗效果的药物组合物，其中，在联 用药物中，通过抑制天冬酰胺酶诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引 起的作用。
[0017] 本发明中，所述的细胞自噬抑制剂选自3-甲基腺噪呤（3-MethyIadenine)、 渥曼青霉素（wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素Al (Bafilomycin Al)、 NH4C1、氯喹（Chloroquine)或羟基氯喹（hydroxychloroquine);更优选的，所述的细胞 自噬抑制剂选自3-甲基腺噪呤（3-Methyladenine)、氯喹（Chloroquine)或羟基氯喹 (Hydroxychloroquine)〇
[0018] 本发明中，所述的天冬酰胺酶选自欧文菌属天冬酰胺酶、大肠埃希菌属天冬酰胺 酶、胡萝卜软腐欧文菌属天冬酰胺酶、重组天冬酰胺酶或聚乙二醇修饰的重组人天冬酰胺 酶。
[0019] 本发明中，所述的活性组份序贯使用。
[0020] 本发明中，所述的药物组合物制成固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米 微球。
[0021] 本发明中，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌或乳腺癌； 更优选的，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤包括霍奇金病淋巴瘤（HD)或非霍奇金病淋巴瘤 (NDL),或黑色素瘤。
[0022] 本发明经实验证实，细胞自噬在天冬酰胺酶对白血病的治疗过程中对天冬酰胺酶 有抵抗作用；并且使用细胞自噬抑制剂能加强天冬酰胺酶对白血病的疗效。
[0023] 本发明基于目前主要用于肿瘤治疗的化疗药物大多产生耐药性及对患者有较强 的副作用，而近年来的生物大分子药物具有高靶向性、高效、低毒副作用等优点，虽然天冬 酰胺酶的抗肿瘤作用得到了广泛的论证，但其在体内存在若干潜在的毒副作用，因此本发 明提供了能加强其活性而降低其用量和毒副作用的由一种或者几种自噬抑制剂与天冬酰 胺酶制成药物组合物，通过联合给药或是序贯给药，从而加强了天冬酰胺酶的抗肿瘤疗效。 本发明优选的实验例显示，天冬酰胺酶能显著诱导白血病细胞发生细胞自噬，而细胞自噬 则会部分抵消天冬酰胺酶的抗肿瘤效果，通过使用细胞自噬抑制剂抑制细胞自噬能增加白 血病细胞对天冬酰胺酶的敏感性，从而增强天冬酰胺酶的疗效。
[0024] 本发明的一种或多种细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶制成复方药物、组合物联合给 药或是序贯使用能增强天冬酰胺酶对肿瘤的杀伤作用，增强天冬酰胺酶的疗效，进一步为 临床实践提供了新的肿瘤治疗技术。
【附图说明】
[0025] 图1显示了天冬酰胺酶能诱导K562细胞发生细胞自噬情况，
[0026] 其中，图IA显示了给药组细胞内有大量的典型的双层膜结构自噬体，图IB显示给 药组细胞内有大量的荧光斑点，而对照组较少；图IC显示，与对照组相比，给予天冬酰胺酶 组的K562细胞的LC3 II的表达水平增强。
[0027] 图2显示抑制自噬能增强天冬酰胺酶诱导的K562细胞死亡，
[0028] 图3显不抑制细胞自噬后细胞内相关蛋白的表达水平检测结果，
[0029] 其中，图3A显示了经过10iimol/L LY294002和0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理后的 K562细胞的LC3 II的表达量低于0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞；
[0030] 图3B显示了经过0. 5IU/ml天冬酰胺酶和10μmol/L的CQ处理后的K562细胞的 LC3 II的表达量高于0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞；
[0031] 图 3C 显示了经过 10μmol/L 的 LY294002 或 10μmol/L 的 CQ 与 0? 5IU/ml 天冬酰 胺酶联合处理后的K562细胞的Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase的表达量高于0? 5IU/ml 天冬酰胺酶单独处理后的K562细胞。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1 :天冬酰胺酶的配制
[0033] 天冬酰胺酶(欧文）的配制：取适量天冬酰胺酶(欧文）溶于纯水配成lOOOIU/ml的 储存液，用〇. I y m的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验用PRMI-1640培养基稀释到相应 浓度。
[0034] 实施例2 :自噬抑制剂药物的配制
[0035] (1)氯喹的配制：取适量氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用0.1 iim的滤 器过滤除菌后保存于4°C，体外实验用PRMI-1640培养基稀释500-1000倍用于抑制细胞自 喔；
[0036] (2)氯化铵的配制：取适量氯化铵溶于水配成0. 4mol/L的储存液，用0.1 m的滤 器过滤除菌后保存于4°C，体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；
[0037] (3)羟基氯喹的配制：取适量羟基氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用 0.1 U m的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；
[0038] (4) 3-MA的配制