：取适量3-MA干粉配制成0. 2mol/L的储存液，用0.1 ii m的滤器 过滤除菌后保存于_20°C。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬；
[0039] (5)LY294002的配制：取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0? Iiim 的滤器过滤除菌后保存于-20°C。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬；
[0040] (6)巴伐洛霉素Al的配制：取适量巴伐洛霉素Al干粉配制成0. 5 y g/ml的储存 液，用0.1 U m的滤器过滤除菌后保存于-20°C，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自 喔；
[0041] (7)自噬抑制剂与天冬酰胺酶联合应用于体内或体外抗肿瘤时，自噬抑制剂3-MA 的使用浓度范围为0-lmol/L，自噬抑制剂CQ的使用浓度范围为0-50mol/L，羟基氯喹的使 用浓度范围为0-50mol/L，LY294002的使用浓度范围为0-lmol/L，巴伐洛霉素Al的使用浓 度范围为0-10m〇l/L，天冬酰胺酶的使用浓度范围为0-100IU/ml。
[0042] 实施例3:药物组合物的配比
[0043] (1)天冬酰胺酶与氯喹冻干粉：天冬酰胺酶(欧文）1000IU，氯喹8g，辅料甘氨酸 〇. lg，用时稀释到相应的浓度。
[0044] (2)天冬酰胺酶与羟基氯喹冻干粉：天冬酰胺酶(欧文）1000IU，羟基氯喹8. 5g，辅 料甘氨酸〇. lg，用时稀释到相应的浓度。
[0045] (3)天冬酰胺酶与3-MA冻干粉：天冬酰胺酶(欧文）1000IU，3-MA2g，辅料甘氨酸 〇. lg，用时稀释到相应的浓度。
[0046] (4)天冬酰胺酶与1^294002冻干粉：天冬酰胺酶（欧文）10001仏1^2940024.2 8，辅 料甘氨酸〇. lg，用时稀释到相应的浓度。
[0047] (5)天冬酰胺酶与巴伐洛霉素Al冻干粉：天冬酰胺酶(欧文M0000IU，巴伐洛霉素 A17. 5g，辅料甘氨酸0. lg，用时稀释到相应的浓度。
[0048] 实施例4:天冬酰胺酶能诱导K562细胞发生细胞自噬
[0049] K562细胞用0. 5IU/ml的天冬酰胺酶处理24h后，进行石蜡包埋、切片、染色，在透 射电子显微镜下观察细胞亚显微结构，结果如图IA所示，给药组细胞内有大量的典型的双 层膜结构自噬体，而对照组则未发现；
[0050] K562细胞用0?5IU/ml的天冬酰胺酶处理24h后，用Cyto-ID?Autophagy Detection Kit自噬体染色试剂盒按说明书处理，随后在激光共聚焦显微镜下观绿色荧光 斑点，结果如图IB显示,给药组细胞内有大量的突光斑点，而对照组较少；
[0051] 将收集到的K562细胞用PBS洗2次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每 个泳道20 y g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3B和 3 -Actin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育I. 5h，用ECL显色液显色。 K562细胞经过天冬酰胺酶处理不同时间或不同浓度后，通过Western Blot的检测，结果如 图IC所示，与对照组相比，给予天冬酰胺酶组的K562细胞的LC3II的表达水平增强。
[0052] 实施例5:抑制自噬能增强天冬酰胺酶诱导的K562细胞死亡
[0053] K562细胞给予0. 04IU/ml的天冬酰胺酶，并在给药前Ih加入10 iimol/L的 LY294002和10μmol/L的CQ抑制细胞自噬；连续培养48h后经过MTT法测定各组的细胞 活力如图2所示，天冬酰胺酶能显著降低K562细胞的细胞活力，与天冬酰胺酶单独使用组 相比，天冬酰胺酶与自噬抑制剂LY294002或CQ联合应用组的K562细胞的细胞活力有显著 性下降，证明自噬抑制剂和天冬酰胺酶的联合给药能更有效地抑制K562细胞的生长，并且 只加抑制剂LY294002和CQ组的细胞活力与对照组相比，无显著差异。说明抑制剂本身对 细胞无明显细胞毒性，因此我们推断了自噬抑制剂和天冬酰胺酶的联合给药所降低的K562 细胞的细胞活性并非是抑制剂和药物的协同作用所致，而是因为抑制自噬后增加了 K562 细胞对天冬酰胺酶的药物敏感性。结论：抑制自噬能增加天冬酰胺酶对K562细胞的杀伤作 用。
[0054] 实施例6:抑制细胞自噬后细胞内相关蛋白的表达水平检测
[0055] 药物处理细胞，用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔20 ii g蛋白量 上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光，结果 如图3所示：经过0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理的K562细胞的LC3II的表达量高于对照组，经 过10μmol/L LY294002和0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞的LC3 II的表达量低 于0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理后的K562细胞，如图3A所示，而经过0. 5IU/ml天冬酰胺酶和 10μmol/L的CQ处理后的K562细胞的LC3 II的表达量高于0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理后 的K562细胞，如图3B所示，经过0. 5IU/ml天冬酰胺酶处理的K562细胞的Cleaved-PARP、 Cleaved-Caspase的表达量高于对照组，经过10 u mol/L的LY294002或10 u mol/L的CQ 与0. 5IU/ml天冬醜胺酶联合处理后的K562细胞的Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase的表 达量高于〇. 5IU/ml天冬酰胺酶单独处理后的K562细胞，如图3C所示，由于LY294002是 一种PI3K抑制剂，PI3K在细胞自噬的调控中起重要的作用，其能与Becilnl等分子结合， 参与调控自噬体膜的运输，因此抑制PI3K将阻遏自噬体的形成，从而起到抑制细胞自噬的 作用，从现象上看，由于自噬体膜的形成与运输受阻，导致ATG8/LC3分子无法通过泛素化 在自噬体膜上定位，所以LC3 II分子的表达水平会因此下降，故而Western Blot的结果证 明10μmol/L的LY294002能抑制由0. 5IU/ml天冬酰胺酶所诱导的K562细胞的细胞自 噬。而CQ是自噬溶酶体的抑制剂，CQ能造成溶酶体的碱化，使溶酶体酶失去活性，从而造 成自噬体的堆积，这造成了自噬体无法在溶酶体内进行降解，导致了处于自噬体膜表面的 LC3 II分子的量增加。所以Western Blot的结果能证明10μmol/L的CQ能抑制由0? 5IU/ ml天冬酰胺酶诱导的K562细胞的细胞自噬。PARP是caspase家族蛋白的剪切底物，经 剪切后变为其剪切形式Cleaved-PARP，Cleaved-PARP的量的多少能直接地反应细胞凋亡 的程度，同时Caspase的剪切的量的多少也直接反应细胞凋亡的程度，即Cleaved-PARP、 Cleaved-Caspase表达量越多则细胞凋亡越显著；本实验结果可进一步支持"抑制细胞自 噬能增强人天冬酰胺酶诱导的白血病细胞凋亡"的结论。
【主权项】
1. 将一种或多种细胞自噬抑制剂和一种或多种天冬酰胺酶的活性组份联合用于制备 用于增强天冬酰胺酶对肿瘤的治疗效果的药物组合物，其中，在联用药物中，通过抑制天冬 酰胺酶诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的作用。2. 按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-甲基 腺噪呤（3-Methyladenine)、渥曼青霉素（wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素 Al (Baf ilomycin Al )、NH4C1、氯喹（Chloroquine)或羟基氯喹（hydroxychloroquine)。3. 按权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-甲基 腺噪呤（3-Methyladenine)、氯喹（Chloroquine)或羟基氯喹（Hydroxychloroquine)。4. 按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的天冬酰胺酶选自欧文菌属天 冬酰胺酶、大肠埃希菌属天冬酰胺酶、胡萝卜软腐欧文菌属天冬酰胺酶、重组天冬酰胺酶或 聚乙二醇修饰的重组人天冬酰胺酶。5. 按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的活性组份序贯使用。6. 按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物制成固体、溶液、 分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球。7. 按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤、黑色 素瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌或乳腺癌。8. 按权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤是白血病、淋巴瘤或黑色 素瘤。9. 按权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的淋巴瘤是霍奇金病淋巴瘤 (HD)或非霍奇金病淋巴瘤（NDL)。
【专利摘要】本发明属生物制药领域，涉及治疗肿瘤的药物组合物，具体涉及自噬抑制剂与天冬酰胺酶组合物及其在制备肿瘤增效药物中的用途。本发明的组合药物包含一种或多种细胞自噬抑制剂与天冬酰胺酶活性组份，其特点在于，细胞自噬抑制剂自身无明显细胞毒性但能通过抑制细胞自噬增强天冬酰胺酶的疗效，从而降低天冬酰胺酶在治疗肿瘤时的用量，减少其潜在的副作用和降低治疗成本。本发明的药物组合物通过联合给药或是序贯给药，能增强天冬酰胺酶的抗肿瘤疗效。本发明优选增加白血病细胞对天冬酰胺酶的敏感性。
【IPC分类】A61K38/50, A61K45/00, A61P35/00, A61P35/02
【公开号】CN104971348
【申请号】CN201410133525
【发明人】鞠佃文, 宋平, 范佳君, 王子玉, 李玉彬, 曾贤, 王绍飞, 赵舒薇
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月3日