μ Μ、5 μ Μ、 2· 51 μ Μ、0 μ Μ)厄洛替尼+30 μ M水飞蓟宾；
[0050] ALK-TKI 敏感株 Η2228 组：给予（10 μΜ、1 μΜ、0· 1 μΜ、0· 01 μΜ、0· 001 μΜ、0 μΜ) 克唑替尼；
[0051] ALK-TKI 敏感株 Η2228+ 水飞蓟宾组：给予（10μΜ、1 μΜ、0· 1 μΜ、0· 01 μΜ、 0· 001 μ Μ、0 μ Μ)克唑替尼+30 μ M水飞蓟宾；
[0052] ALK-TKI 耐药株 H2228-CR 组：给予（10 μΜ、1 μΜ、0· 1 μΜ、0· 01 μΜ、0· 001 μΜ、 0 μ Μ)克唑替尼；
[0053] ALK-TKI 耐药株 H2228-CR+水飞蓟宾组：给予（10μΜ、1μΜ、0· 1μΜ、0·01μΜ、 0· 001 μ Μ、0 μ Μ)克唑替尼+30 μ M水飞蓟宾；
[0054] EGFR-TKI 敏感株 PC-9 组：（16 μ Μ、8 μ Μ、4 μ Μ、2 μ Μ、1 μ Μ)索拉菲尼
[0055] EGFR-TKI 敏感株 PC-9+水飞蓟宾组：（16 μΜ、8μΜ、4μΜ、2 μΜ、1 μΜ)索拉菲尼 +30 μ M水飞蓟宾；
[0056] EGFR-TKI 耐药株 PC-9GR 组：（16μΜ、8μΜ、4μΜ、2μΜ、1 μΜ)索拉菲尼
[0057] EGFR-TKI 耐药株 PC-9GR+水飞蓟宾组：（16μΜ、8μΜ、4μΜ、2μΜ、1 μΜ)索拉菲尼 +30 μ M水飞蓟宾；
[0058] (4)给药后，置入培养箱继续培养48h ;随后在倒置显微镜下观察药物的作用效 果；
[0059] (5)弃加药的培养基，每孔重新加入100 μ L新鲜10% FBS培养液，在加入含10 μ L MTT(5mg/mL，即0. 5% ΜΤΤ)，继续培养4h ;待结晶充分形成，彻底去掉孔内培养液，每孔加 入150 μ L二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪 0D490nm处测量各孔的吸光值。进而计算各组细胞的存活率或者各组的IC 5。值。
[0060] 4.实验结果
[0061] 如图2和图3所示，加入30 μ M水飞蓟宾后，可显著提高ALK-TKI敏感株H2228细 胞和ALK-TKI耐药株H2228-CR细胞对克唑替尼的敏感性，表现为各个浓度的克唑替尼作 用下，水飞蓟宾的加入均能显著降低细胞的存活率；如图1所示，加入30 μΜ水飞蓟宾后， EGFR-TKI敏感株Η1650细胞、和EGFR-TKI耐药株Η1650-Μ3细胞对厄洛替尼的IC5。没有太 大的影响；如图4所示，加入30 μΜ水飞蓟宾后，EGFR-TKI敏感株PC-9细胞、和EGFR-TKI 耐药株PC-9GR细胞对索拉菲尼的IC5。没有太大的影响
[0062] 5.结论
[0063] 水飞蓟宾能够增强ALK-TKI的疗效，并且能够延缓ALK-TKI的耐药；水飞蓟宾不能 够增强厄洛替尼及索拉菲尼对非小细胞肺癌的疗效，并且也不能够延缓厄洛替尼及索拉菲 尼的耐药。
[0064] 实施例2体外实验
[0065] 实验目的：水飞蓟宾能否降低ALK-TKI耐药细胞的侵袭性实验；
[0066] 实验方法：采用Transwell方法计算肺癌细胞的侵袭性；
[0067] 实验步骤如下：
[0068] (1)选择 Transwell chamber :24_well 6. 5mm Diameter Ineserts8. 0 μm Pore Size (Corning Incorporated)。
[0069] (2)提前向Transwell chamber上室加入IOOuL无血清培养液，下室加入600 μ m 血清培养液（10% FBS)，并放入37°C培养箱中孵育2h ;
[0070] (3)实验共分为9组，具体为：ALK-TKI敏感株H2228组、EGFR-TKI敏感株H1650 组、ALK-TKI 耐药株 H2228-CR 组、EGFR-TKI 耐药株 H1650-M3、ALK-TKI 耐药株 H2228-CR+ 水 飞蓟宾组、EGFR-TKI耐药株H1650-M3+水飞蓟宾组、EGFR-TKI敏感株PC-9组、EGFR-TKI耐 药株PC-9GR组、EGFR-TKI耐药株PC-9GR+水飞蓟宾组；用胰酶消化细胞，离心后培养液重 悬，用PBS和无血清培养液前后各洗涤一次；
[0071] (4)用无血清培养基重悬细胞，计数，调整浓度为2X105/mL，向Transwell chamber上室加入IOOuL细胞悬液，将24孔板继续在5 % CO2、37 °C、90 %湿度细胞培养箱中 培养48小时；
[0072] (5)48小时后，弃去滤膜上室和下室的培养液，在上下室分别加入等体积（上室 200uL、下室600uL)的预热PBS，轻轻吹打PBS清洗滤膜下表面；
[0073] (6)向下室加入4%多聚甲醛800 μ L，使滤膜下表面浸在其中固定细胞20min ;
[0074] (7)弃固定液，用PBS清洗2次，倒置transwell小室，使滤膜下面朝上，自然风干。
[0075] (8)在上下室分别加入（上室200uL、下室800uL)的结晶紫染液，染色20min。
[0076] (9)大量蒸馏水分别清洗24孔板和transwell小室，用棉球擦去上表面未迀移的 细胞，在倒置显微镜下观察计数（H1650-M3穿过小室膜贴壁于24孔内，计数加上；随机选取 5个高倍视野，计数细胞数后求平均值。
[0077] 实验结果
[0078] 水飞蓟宾能够显著降低耐药细胞的侵袭性：如图5所示，ALK-TKI耐药株H2228-CR 发生侵袭的细胞数平均值为238个，水飞蓟宾处理使其下降至86个（统计学处理有显著差 异，p〈0. 01);如图6所示，EGFR-TKI耐药株H1650-M3发生侵袭的细胞数平均值为209个， 水飞蓟宾使其下降至200个（统计学计算没有显著差异，p > 0. 01);如图7所示，EGFR-TKI 耐药株PC-9GR发生侵袭的细胞数平均值为288个，水飞蓟宾使其下降至276个（统计学计 算没有显著差异，P >0.01)。
[0079] 实验例3体内实验
[0080] 实验目的：水飞蓟宾能否提高ALK-TKI敏感株H2228细胞对ALK-TKI的敏感性和 抑制肿瘤生长实验
[0081] ALK-TKI敏感株H2228细胞，实验动物选用裸鼠（北京维通利华实验动物技术有限 公司，雌鼠，实验分3组（对照组和实验1组、实验2组），每组6只动物，共18只）
[0082] 实验步骤如下：
[0083] (1)选取裸鼠6周龄，接种肿瘤细胞前，需在饲养地方喂养1周；
[0084] (2)给每只裸鼠右侧腋下接种肿瘤细胞H2228 :2X 106,重构建裸鼠移植瘤模型；
[0085] (3)从接种肿瘤细胞第10天起进行裸鼠体重称重（电子秤测量）和肿瘤体积测 量（游标卡尺测量）。测量瘤体最长径（a)与最短径（b),并计算肿瘤相对体积V(mm 3)= ab2/2,每周测量2次；
[0086] (4)待移植瘤体积达50mm3左右时，将动物随机分成3组并给予相应药物口服：
[0087] 对照组：给予克唑替尼（170mg/L);
[0088] 实验1组：给予克唑替尼（170mg/L)+水飞蓟宾（350mg/L);
[0089] 实验2组：给予索拉菲尼（170mg/L)+水飞蓟宾（350mg/L);
[0090] (5)三组均每天给药，持续4周；4周后处死裸鼠，测量肿瘤最终体积，计算抑瘤率； 抑瘤率=(对照组相对体积一实验组相对体积）/对照组相对体积X100% ;取瘤组织，一 部分于中性福尔马林固定，一部分于液氮中保存备用。绘制肿瘤生长曲线。
[0091] 实验结果
[0092] 如图8所示，实验1组的肿瘤体积相对于对照组和实验2组显著缩小，且有 统计学显著差异。如图9所示，在治疗起始，3组肿瘤平均体积一致，分别为10. 53_3， 11. 41mm3, 11. 62mm3;治疗4周后，对照组肿瘤平均体积为2254. 5mm3,实验1组肿瘤平均体积 为1512. 3_3,实验2组组肿瘤平均体积为2156. 4_3;实验1组与对照组和实验2组相比肿 瘤有缩小，具有统计学显著差异，而实验2组与对照组相比，肿瘤体积没有太大变化，无统 计学差异。
[0093] 实验结论
[0094] 与单独应用克唑替尼相比，克唑替尼联合水飞蓟宾可显著减弱移植瘤的生长。表 明水飞蓟宾可显著增强克唑替尼治疗非小细胞肺癌的疗效；然后水飞蓟宾不能增强索拉菲 尼治疗非小细胞肺癌的疗效。
【主权项】
1. 水飞劑宾或其盐在制备增强ALK-TKI疗效、延缓其耐药的药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ALK-TKI选自克挫替尼或色瑞替尼。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ALK-TKI为克挫替尼。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述盐为水飞劑宾葡甲胺、水飞劑宾精氨酸 或水飞劑宾组氨酸。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水飞劑宾或其盐的使用剂量为 70-700mg/ 日。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水飞劑宾或其盐的使用剂量为300mg/ 曰。7. -种增强ALK-TKI疗效、延缓其耐药的缓释片，其特征在于，所述缓释片包括重量份 数为5-15份的水飞劑宾或其盐和重量份数为20-50份的辅料。8. 如权利要求7所述的缓释片，其特征在于，所述辅料包括辛基酪聚氧乙締酸、海藻酸 丙二醇醋、微晶纤维素、辛基十二烧醇和簇甲基纤维素钢；所述辛基酪聚氧乙締酸、海藻酸 丙二醇醋和微晶纤维素与水飞劑宾或其盐形成微囊；所述缓释片各成分的重量份数为： 水飞蘭宾或其盐 10 辛基齡聚氧乙婦酸 1贷 海藻酸丙二醇醋 12, S 微晶纤维素 2.5 辛基十二繞醇 3 綾甲基纤维素钢 授:。9. 一种权利要求8所述的缓释片的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： a. 将水飞劑宾或其盐加入辛基酪聚氧乙締酸和海藻酸丙二醇醋中，研磨至均匀，制得 水飞劑宾或其盐研磨物；将微晶纤维素按体积比为1:3加入水中，制得水溶液；将水飞劑宾 或其盐研磨物和水溶液混合均匀，于高速剪切乳化，制得水飞劑宾或其盐初乳；将水飞劑宾 或其盐初乳置于高压匀质机中乳化，制得水飞劑宾或其盐乳液；将水飞劑宾或其盐乳液喷 雾干燥，制得粒径范围为15-25ym的水飞劑宾或其盐微囊； b. 将水飞劑宾或其盐微囊与簇甲基纤维素钢混合均匀，制得混合粉； C.将3/4的辛基十二烧醇溶于无水乙醇中，加入混合粉，混合均匀，制软材；d.将软材过20目筛，制湿颗粒，将湿颗粒喷雾干燥，进行整粒，与剩余的辛基十二烧醇 混合均匀，压片，制得。10. 如权利要求7-8任一所述的缓释片在制备增强ALK-TKI疗效、延缓其耐药的药物中 的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种水飞蓟宾或其盐的新用途，特别涉及水飞蓟宾或其盐在制备增强ALK-TKI疗效、延缓其耐药的药物中的应用；水飞蓟宾能够显著降低耐药细胞的侵袭性：使ALK-TKI耐药株H2228-CR发生侵袭的细胞数平均值从238至86个；此外，水飞蓟宾联合克唑替尼可显著减弱移植瘤的生长；表明水飞蓟宾可显著增强克唑替尼的疗效。
【IPC分类】A61K31/357, A61K31/506, A61P1/16, A61K9/26, A61P11/00, A61K47/10, A61K31/4545, A61P35/00
【公开号】CN104997781
【申请号】CN201510411600
【发明人】何勇, 李力
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月14日