0, 81. 0, 81. 6, 98. 1, 98. 6, 111. 9, 112. 5, 119. 7, 122. 5, 143. 5, 143. 6, 148. 4, 149. 1, 151. 9, 152. 9。化合物VI(TatarinanV)为天然来源首次分离得到。
[0086] 上述的波谱数据表明了本发明的化合物的结构鉴定过程。通过波谱数据及X单晶 衍射结果能够鉴定出本发明的化合物的结构式。
[0087]化合物I至VI的活性实验[0088] 1、细胞分离实验：
[0089] 为了测定化合物I至VI的活性，首先需要对骨髓细胞进行分离，以得到符合实验 测定要求的目标细胞。对骨髓细胞进行分离的方法包括如下步骤：
[0090](1)、取6周龄的雄性C57/6L-J小鼠（购自上海实验动物中心），采用颈椎脱臼法 处死；
[0091](2)、无菌剥取胫骨、股骨和髂骨，剪去骨两端，用PBS冲洗骨髓腔得到骨髓细胞， 于420g离心5min;
[0092] (3)、将分离得到的骨髓细胞用含10%胎牛血清和20即/11111-05?的€[-|^1培 养液制备细胞悬液，加入到l0cm培养皿中，于37°C下在含5% 0)2的培养箱中培养过夜；
[0093] (4)、吸取未贴壁细胞，于42(^离心51^11，采用含10%胎牛血清、1%双抗和2〇1^/ mlM-CSF的a-MEM培养液重悬细胞，以合适的细胞密度培养3d，得到的贴壁细胞被作为 骨髓衍生的巨噬细胞（BMMs)。
[0094] 2、细胞毒性实验：
[0095] 为了获知化合物I至VI对骨髓衍生的巨噬细胞（BMMs)的毒性，采用MTT法进行测 定。MTT法测定化合物I至VI的细胞毒性的步骤如下所示：
[0096](1)、按照5X104细胞/孔的细胞密度将BMMs接种到96孔板培养，洗去未贴壁细 胞后，继续培养24h;
[0097](2)、按实验要求将BMMs细胞分为RANKL对照组和待测化合物组，在待测化合物组 的每组细胞加入不同浓度的待测化合物，孵育30min后再加入RANKL(20ng/ml)进行刺激；
[0098](3)、于37°C，5%C02的条件下孵育24h后，加入MTT溶液并继续培养4h。形成的 MTT-formazan结晶用100y1 0. 04N盐酸-异丙醇溶解，之后在570nm测定吸光度，结果如 图4所示。
[0099] 图4显示了化合物I至VI在5yM和10yM的浓度下对BMMs的毒性，其纵坐标表 示细胞活性（Cellviability)，用待测化合物组各组的吸光度值与RANKL对照组的吸光度 的比值（％ofthecontrol)进行表示；横坐标中的5yM和10yM表示待测化合物组中各 个化合物的浓度。
[0100]由图4可知，化合物I至VI在最大浓度为10yM时对BMMs无显著的细胞毒效应。
[0101] 3、破骨细胞的生成抑制实验
[0102] BMMs分化为破骨细胞从而导致破骨细胞数目的增多，而破骨细胞的异常增多是导 致骨质疏松的原因之一。本实验旨在探索化合物I至VI对BMMs被诱导分化为破骨细胞的 影响。
[0103] 实验步骤如下所示：
[0104] 将上面得到的BMMs以6xl04细胞/孔的密度置于48孔板，用包含10%胎牛血清、 20ng/mlM-CSF、20ng/mlRANKL以及不同浓度待试药物（即化合物I至VI)的a-MEM培 养液在37°C含5%C02培养箱中培养3d。随后，移去培养液，并用购自Sigma的TRAP染色 试剂盒中所携带的固定液固定细胞后，按照试剂盒说明进行TRAP染色。在避光的37°C培养 箱中孵育lh后，染色的细胞用蒸馏水洗3遍，在200倍光学显微镜下观察细胞。TRAP染色 阳性的细胞呈暗红色。包含3个及3个以上细胞核的TRAP染色阳性细胞被视为破骨细胞。 实验结果如图5至图8所示。图5至图8的放大比例相同。
[0105] 图5为对照组和化合物I处理组的破骨细胞的TRAP染色图。图5的左上图表示 未用RANKL刺激下的TRAP染色图，提示在未用RANKL刺激的条件下，BMMs不会分化为破骨 细胞；图5的右上图表示使用RANKL刺激下的TRAP染色图，提示在使用RANKL刺激并且未 添加化合物I至VI的条件下，BMMs能够分化为破骨细胞；图5的左下图表示使用RANKL刺 激并添加了 10yM的化合物1(即化合物I)的条件下的TRAP染色图，由该图可以看出，在 添加了一定浓度的化合物I后，BMMs分化为破骨细胞的过程被显著抑制；图5的右下图表 示使用RANKL刺激并添加了 5yM的化合物I的条件下的TRAP染色图，由该图可以看出，在 添加了一定浓度的化合物I后，BMMs分化为破骨细胞的过程被显著抑制，但是高浓度的化 合物I的抑制分化效果强于低浓度的化合物I。
[0106] 图6为化合物II处理组和化合物III处理组的破骨细胞的TRAP染色图。图6的左 上图表示使用RANKL刺激并添加了 10yM的化合物2 (即化合物II)的条件下的TRAP染色 图，由该图可以看出，在添加了一定浓度的化合物II后，BMMs分化为破骨细胞的过程被显著 抑制；图6的右上图表示使用RANKL刺激并添加了 5yM的化合物II的条件下的TRAP染色 图，由该图可以看出，在添加了一定浓度的化合物II后，BMMs分化为破骨细胞的过程被显著 抑制；图6的左下图表示使用RANKL刺激并添加了 10yM的化合物3 (即化合物III)的条件 下的TRAP染色图，由该图可以看出，在添加了一定浓度的化合物III后，BMMs分化为破骨细 胞的过程被显著抑制；图6的右下图表示使用RANKL刺激并添加了 5yM的化合物III的条件 下的TRAP染色图，由该图可以看出，在添加了一定浓度的化合物III后，BMMs分化为破骨细 胞的过程被显著抑制；从图6可以看出，10yM的化合物III的抑制效果优于10yM的化合物 II的抑制效果。
[0107] 图7为化合物IV处理组、化合物V处理组和化合物VI处理组的破骨细胞的TRAP染 色图。图7的左上图表示使用RANKL刺激并添加了 10yM的化合物4(即化合物IV)的条 件下的TRAP染色图；图7的右上图表示使用RANKL刺激并添加了 5yM的化合物IV的条件 下的TRAP染色图；图7的左中图表示使用RANKL刺激并添加了 10yM的化合物5 (即化合 物V)的条件下的TRAP染色图；图7的右中图表示使用RANKL刺激并添加了 5yM的化合 物V的条件下的TRAP染色图；图7的左下图表示使用RANKL刺激并添加了 10yM的化合 物6(即化合物VI)的条件下的TRAP染色图；图7的右下图表示使用RANKL刺激并添加了 5yM的化合物VI的条件下的TRAP染色图。
[0108] 对上述各组的TRAP染色阳性细胞进行计数并进行统计和计算，得到图8。图8显 示了化合物I至VI在5 yM和10 yM的浓度下对BMMs分化的抑制效应，其纵坐标表示TRAP 染色阳性的细胞（TRAP+MNCs)的数目相对于对照组（仅采用RANKL刺激）的细胞数目的百 分比，横坐标中的5 yM和10 yM表示待测化合物组中各个化合物的浓度。图8中，与对照 组相比，*p〈〇. 05 ;**p〈0. 01 ;***p〈0. 001。
[0109] 由图5至图8可知，化合物I至VI在5yM和10yM的浓度下均显著抑制RANKL诱 导的BMMs中TRAP阳性的多核细胞形成，这表明化合物I至VI均能以浓度依赖的方式抑制 RANKL诱导的破骨细胞生成。
[0110] 4、骨吸收抑制实验
[0111] 破骨细胞的作用之一就是进行骨吸收，如果骨吸收过度，则会引起各种与骨丢失 有关的疾病，如骨质疏松。本实验旨在探索化合物I至VI对破骨细胞的骨吸收作用的影响。
[0112] 本实验采用CorningOsteoAssaySurface24孔板体外系统作为骨吸收分析方 法，该CorningOsteoAssaySurface24孔板表面覆盖有轻磷灰石矿物质涂层，已经被发 表于PNAS等国际权威刊物上的多篇文章公开，实验步骤如下所示：
[0113]将BMMs以 1X105细胞 / 孔的密度接种到CorningOsteoAssaySurface24 孔板 中，用包含10%胎牛血清、20ng/mlM-CSF、20ng/mlRANKL以及不同浓度待试药物（即化 合物I至VI)的a-MEM培养液在37°C含5%C02培养箱中培养6d，并且每隔3d更换新鲜 的培养液及化合物；6d后，移去培养液，用5% (w/v)次氯酸钠溶液处理细胞5min，以去除 细胞；蒸馏水漂洗5次，采用经过修正的VonKossa染色方法染色，方法如下：次氯酸钠去除 培养板中的细胞后，用浓度为5% (w/v)的硝酸银按300yL/孔的体积避光室温孵育30min 后，蒸馏水漂洗5次，随后用浓度为5% (w/v)的溶于10%福尔马林的碳酸钠溶液于室温孵 育5min，蒸馏水漂洗5次后，吸干，空气干燥后，使用倒置光学显微镜成像，并使用ImageJ 分析软件计算每孔的骨吸收面积。结果如图9至图12所示。图9至图11的放大比例相同。
[0114] 图9为对照组、化合物I和化合物II处理组的VonKossa染色图。图9的第一行 左图表示采用RANKL刺激下的VonKossa染色图，显示了该种情况下的骨吸收