后取出。
[0113] (4)将冷冻包埋好的组织用冰冻切片机连续切片，厚度为5ym，制成冰冻切片，切 片暂时冷冻于-20°C备用。
[0114]2. 8. 2免疫荧光染色
[0115] (1)冰冻切片室温复温30分钟；
[0116] ⑵冰丙酮固定8min，4°CPBS洗3次X5分钟
[0117](3) 3%BSA室温封闭30分钟
[0118] (4)滴加一抗F4/80抗体（用一抗稀释液1:200稀释）和P65抗体（用一抗稀释 液1:200稀释）双染4°C过夜，4°CPBS洗3次X5分钟；
[0119] (5)滴加AlexaFluor488驴抗小鼠荧光二抗和AlexaFluor594驴抗兔荧光二 抗（1:200稀释）室温避光孵育1小时，4°CPBS洗3次X5分钟；
[0120] (6)DAPI染核1分钟，4°CPBS洗3次X5分钟。
[0121] (7)Vectashieldmedium封片。焚光共聚焦显微镜下观察、拍照。
[0122] 2. 9小鼠脾细胞流式细胞术
[0123] 于免疫后第21天（day21)检测伏立诺他组小鼠和对照组脾脏Thl7细胞、Thl细 胞占单个核细胞比例，Treg细胞、ThO细胞分别占⑶4+T淋巴细胞的比例，每组各取5只小 ￡3邱u
[0124] 2. 9. 1小鼠脾脏单细胞悬液的制备
[0125] (1)小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸入75%的酒精中10分钟，小鼠取右 侧卧位，逐层剖开腹腔，充分暴露脾脏，无菌条件下取出脾脏放入含有1%BSA的无菌培养 皿中，小心去除筋膜与脂肪组织，并用剪刀将脾脏分割成小碎块（1-2_);
[0126] (2)无菌50ml离心管上放置一无菌的40ixm无菌尼龙网，将分割完成的脾脏组织 置入其上，无菌滴管滴入1%BSA;
[0127] (3)用5ml的注射器内栓轻轻研磨脾脏，同时加入适量1%BSA冲洗，至研磨充分， 共约10ml脾脏单细胞悬液；
[0128] (4)将离心管置于离心机中，调整离心条件：25°C，1200rpm，离心5min，轻轻弃去 上清；
[0129] (5)加入5_6ml红细胞裂解液并缓慢摇动使细胞重悬；
[0130] (6)室内静置4-5min，待红细胞裂解完成，加入10ml无菌PBS终止细胞裂解；
[0131](7)加入 10ml1 %BSA后离心，25°C，1200rpm，离心lOmin，弃上清，加入 10ml1 % BSA，轻晃离心管，重悬细胞；
[0132] (8)静置 2-3min后，25°C，1200rpm，离心lOmin，弃上清，加入 700y1 1%BSA，重 悬细胞；
[0133] (9)取10y1单细胞悬液，行细胞计数；
[0134] (10)根据细胞计数结果调整细胞密度为5X106/ml。
[0135] 2. 9. 2小鼠脾脏Thl和Thl7细胞的流式检测
[0136] 2. 9. 2. 1刺激Thl和Thl7细胞因子分泌
[0137] (1)取无菌24孔板，每孔加100y1上述脾脏单细胞悬液，900y1配好的培养基， 0. 5y1lmg/mlPMA(H^|t^j500ng/ml) ,0. 5y1lmg/ml (H^|t^j500ng/ml), 1y1BFA(1yg/ml)，轻轻混勾，37°C无菌温箱培养4h。
[0138] (2)取出24孔板，轻轻混匀孔内液体，吸出至相应流式管中。
[0139] (3)将装有细胞悬液的流式管置于离心机中离心：25°C，2000rpm，3min，弃上清。
[0140] (4)加 2mlPBS重悬细胞，25。(：离心 2000rpm，3min，弃上清。
[0141]2. 9. 2. 2Thl和Thl7细胞胞外染色
[0142] (1)流式管标号，加入小鼠FITC-⑶4抗体，轻轻敲打混匀，室温避光孵育15min;
[0143] (2)加入lmlPBS混匀，2000rpm，25°C，离心 5min，弃上清；
[0144](3)再次加入lmlPBS重悬，2000rpm，25°C，离心5min，弃上清。
[0145] 2. 9. 2. 3 胞内染色
[0146] (1)各流式管中加入500y1破膜剂，室温避光破膜20min;
[0147] (2) 25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0148](3)各流式管中加入1ml破膜buffer(1X)，重悬细胞，25°C，350g，离心5min，弃上 清；
[0149] (4)用于Thl细胞染色的流式管中加入1y1小鼠PE-IL-17抗体，用于Thl7细胞 染色的流式管中加入1y1小鼠PE-IFN-y抗体，轻轻敲打混匀，室温避光孵育20min;
[0150] (5)加入lmlPBS溶液，重悬细胞，置于离心机中离心，条件：25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0151] (6)重复上一步骤；
[0152] (7)加入500y1 4%甲醛溶液固定细胞，4°C避光保存过夜；
[0153](8) 25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0154] (9)加入500y1鞘液重悬细胞，滤网过滤，上机检测分析。
[0155] 2. 9. 3小鼠脾脏Treg细胞的流式检测
[0156] 2. 9. 3. 1细胞表面染色
[0157] 取制备好的脾脏单细胞悬液100y1置于流式管中，标号，依次加入小鼠FITC-⑶4 抗体2y1，小鼠Percp-Cy5. 5-⑶25抗体3y1，轻轻敲打混匀，常温避光孵育15分钟。
[0158] 2. 9. 3. 2胞内核因子染色
[0159] (1)上述各流式管中加入1ml破膜剂，室温避光破膜30分钟；
[0160](2)各流式管中加入1ml破膜buffer(IX)，室温避光10分钟；
[0161] (3)各流式管置于离心机中25°C，1500rpm，离心5min，弃上清；
[0162] (4)各流式管中加入小鼠PE-Foxp3抗体3y1，室温避光孵育30分钟；
[0163] (5)加入1mlPBS溶液，重悬细胞，25°C，1500rpm，离心5min，弃上清；
[0164] (6)重复上一步骤；
[0165] (7)加入500y1 4%甲醛溶液固定细胞，4°C避光保存过夜；
[0166] (8) 25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0167] (9)加入500y1鞘液重悬细胞，滤网过滤，上机检测分析。
[0168] 2. 9. 4小鼠脾脏ThO细胞的流式检测
[0169] 2. 9. 4. 1细胞表面染色
[0170] (1)取制备好的脾脏单细胞悬液100yl置于流式管中，标号，依次加入小鼠 FITC-CD4 抗体 2y1，小鼠Percp-Cy5. 5-CD3e抗体 3y1，小鼠PE-CD62L抗体 3y1，轻轻敲 打混匀，常温避光孵育15分钟；
[0171] (2)加入1mlPBS溶液，重悬细胞，25°C，1500rpm，离心5min，弃上清；
[0172] (3)重复上一步骤；
[0173] (4)加入500y1 4%甲醛溶液固定细胞，4°C避光保存过夜；
[0174](5) 25°C，350g，离心 5min，弃上清；
[0175] (6)加入500y1鞘液重悬细胞，滤网过滤，上机检测分析。
[0176] 2. 10RNA提取及RT-PCR方法对紧密连接蛋白的定量
[0177] 总RNA以试剂盒（美国Invitrogen公司出品）进行提取，cDNA由TransScript First-StrandcDNASynthesisSuperMix试剂盒（中国TransGenBiotech公司出品）合 成。小鼠Z0-1、claudin-5以及occludin紧密连接蛋白的定量依靠RT-PCR实现，其中以 后-actin作为内参基因。PCR反应条件是：预变性94°C30s，变性95°C20s，退火57°C20s， 延伸72°C20s，循环次数40。以上具体操作方法依照仪器或试剂盒生产厂商的说明进行。 引物序列如表3所示。其中mRNA的相对表达量通过根据系统自动生成的Ct值及熔解曲线， 整理并分析数据，绘制柱状图。
[0178] 分析方法如下：
[0179] Folds= 2AACt
[0180]AACt= (Ctl-Ct2)-(Ct3-Ct4)
[0181] Ctl:处理样本待测基因的临界循环数
[0182] Ct2 :处理样本持家基因（0-actin)的临界循环数
[0183]Ct3:对照样本待测基因的临界循环数
[0184] Ct4 :对照样本持家基因（0-actin)的临界循环数。
[0185] 表3RT-PCR引物序列
[0186]
[0187] 2. 11利用Westernblotting对促炎性细胞因子表达量的测定
[0188] 从小鼠体内切除视网膜和脉络膜，利用蛋白质分析仪进行总蛋白的定量，蛋白的 分离依据以下方法执行：
[0189] (1)蛋白质样品预处理：