n维持出气口氧气 浓度〈1 %。以此模拟缺血过程8h。
[0032] (2)体外模拟再灌注过程：从C02培养箱中取出第一块96孔板，正常培养组每孔更 换100yL新鲜的完全培养基，放入C02培养箱中继续培养4h。从缺氧培养盒中取出第二块 96孔板，缺血再灌注组、TurrapubinD预处理组和生理盐水组每孔用100yL新鲜的完全培 养基置换无糖DMEM培养基，放入C02培养箱中正常条件下（37°C、5%C02、95%空气、饱和湿 度）培养4h，模拟再灌注过程。
[0033] 3、指标检测
[0034] 3. 1MTT法检测肝细胞活力
[0035] (1)MTT溶液配制：用电子微量天平称取250mgMTT，放入小烧杯中，加入50mLPBS搅 拌30min，使之充分溶解，即为浓度为5mg/mL的MTT溶液。在超净工作台中用0.22ym的微 孔滤器除菌，分装为每支lmL，4°C避光保存备用。
[0036] (2)细胞准备：按上述方法进行细胞分组，并另设调零孔。并按上述方法进行 TurrapubinD预处理和体外模拟缺血再灌注过程。
[0037] (3)呈色：终末时间点每孔加入5mg/mL的MTT溶液20yL，放入37°C、5%C02、95% 空气、饱和湿度的C02培养箱中继续培养4h。终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入 100yLDMS0溶液，微量振荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解。
[0038] (4)比色：选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收度⑷，记录结果。实验重 复2次。
[0039] 3. 2乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性检测
[0040] 按GENMED乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒说明书操作，重复 2次。
[0041] (1)按上述方法准备待测细胞，并另设无细胞的培养液（背景空对照孔）和未处理 的后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），作好标记。
[0042] (2)到规定的检测时间点前1小时，从C02培养箱中取出待测的96孔细胞培养板， 加入10yLGENMED裂解液到未处理的后续裂解的细胞孔里，同时加入10yLGENMED补充液 到其余所有检测孔里。放回C02培养箱中继续培养1小时即规定检测时间。
[0043] (3)从C02培养箱中取出待测的96孔细胞培养板，离心lOmin，速度为250g。
[0044] (4)分别小心移取50yL上清液到新的96孔板的相应孔里，同时作好标记。
[0045] (5)混匀GENMED反应液，每孔分别加入50yLGENMED反应液，再分别每孔加入 10yLGENMED显色液，摇动96孔板混匀。
[0046] (6)在室温下孵育30min，避免光照。
[0047] (7)每孔分别加入10yLGENMED终止液。
[0048](8)即刻放进酶标仪里测定光吸收度（A)，选择波长570nm。
[0049] (9)根据以下公式计算细胞死亡率：
[0050] 处理样品实际吸光读数=处理样品孔吸光读数一样品对照孔吸光读数一背景空 对照孔吸光读数
[0051] 样品细胞最大酶活性的实际吸光读数=样品最大酶活性对照孔吸光读数一样品 对照孔吸光读数一背景空对照孔吸光读数
[0052] 细胞死亡率=(处理样品实际吸光读数+样品细胞最大酶活性的实际吸光读 数）X100%
[0053] 3. 3肝细胞功能指标的测定：
[0054] 按上述方法进行细胞分组、预处理和模拟缺血再灌注损伤。到终末时间点分别 将各孔细胞培养上清液1〇〇yL收集于Ep管中，每管分别加入100yL完全培养基稀释至 200yL，室温下离心5min，速度为1200r/min。取上清液在全自动生化仪下检测ASL、ALT和 LDH水平。实验重复2次。
[0055] 4、统计学处理
[0056] 使用SPSS13. 0软件包进行统计学处理。计量资料采用均数土标准差（x土s) 表示，组间比较采用单因素方差分析，P< 0. 05差异有统计学意义。
[0057] 三、结果及结论
[0058] 1、TurrapubinD预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
[0059]IR组肝细胞活力比N组明显下降（P〈0. 05)，表明体外模拟缺血再灌注过程成功地 造成了肝细胞的缺血再灌注损伤。给予5ng/mlTurrapubinD预处理1小时，缺血再灌注损 伤肝细胞的活力较缺血再灌注组和生理盐水组增强（P〈〇. 05)，但未能恢复到正常组肝细胞 活力水平（P〈〇. 05)，生理盐水组则与缺血再灌注组差异无统计学意义（P>0. 05)。而0. 5ng/ ml和50ng/ml浓度的TurrapubinD预处理1小时，均未能增强缺血再灌注损伤肝细胞的 活力（P>0. 05)，其肝细胞活力与生理盐水组之间差异也无统计学意义（P>0. 05)。结果见表 1 (A表示与N组比较，P〈0. 05,差异有统计学意义芦表示与IR组和NS组比较，P〈0. 05,差异 有统计学意义，下同）。
[0060] 2、TurrapubinD预处理对肝细胞缺血再灌注损伤的细胞繁殖和毒性的影响
[0061] 与正常组相比，体外模拟缺血再灌注损伤使细胞死亡率>90%。给予5ng/ mlTurrapubinD预处理1小时，肝细胞死亡率下降约35%，差异有统计学意义（P〈0. 05)，但 其细胞死亡率仍比正常组高约50%，差异有统计学意义（P〈0. 05);而生理盐水组肝细胞死 亡率比缺血再灌注组虽略有下降（约为8% )，但差异无统计学意义。0. 5ng/ml和50ng/ml 浓度的1'11^&口111^11〇预处理1小时，肝细胞死亡率比缺血再灌注组分别降低6%和13%， 但差异无统计学意义（P>〇. 05);而与生理盐水组的肝细胞死亡率相近（P>0. 05)。结果见表 2〇
[0062] 3、TurrapubinD预处理对缺血再灌注损伤肝细胞肝功能指标的影响
[0063] 与正常组比较，缺血再灌注损伤组细胞培养上清液中的ALT水平未见明显升高 (P>0. 05);而AST、LDH水平以及AST/ALT比值显著升高，差异有统计学意义（P〈0. 05)。给 予5ng/mlTurrapubinD预处理1小时，肝细胞培养上清液中的AST、LDH水平以及AST/ALT 比值较缺血再灌注组和生理盐水组降低，但仍较正常组高（P〈〇. 05);而ALT水平与缺血再 灌注组和生理盐水组比较，差异无统计学意义（P>〇. 05)。生理盐水组细胞培养上清液中的 ALT、AST、LDH水平以及AST/ALT比值与缺血再灌注组之间差异无统计学意义（P>0. 05)。 0? 5ng/ml和50ng/mlTurrapubinD预处理1小时，均未能使肝细胞培养上清液中的AST、 LDH水平降低（P>0. 05)。结果见表3。
[0064] 本研究显示，TurrapubinD(RE2组）使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的 耐受力增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低。以上结果提示，TurrapubinD预处 理能够减轻人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用。
[0065] 表1MTT法检测TurrapubinD预处理对缺血再灌注损伤肝细胞活力的影响
[0066]
[0067] 表2LDH释放法肝细胞繁殖与毒性定量检测细胞死亡率
[0068]
[0069] 表3肝细胞培养上清液中ALT、AST、LDH水平的变化（n= 5)
[0070]
【主权项】
I. TurrapubinD在制备保肝药物中的应用，所述TurrapubinD化学结构式如下，
【专利摘要】本发明公开了Turrapubin？D在制备保肝药物中的应用，属于药物领域。体外试验证明，Turrapubin？D能使肝细胞对之后经历的缺血再灌注损伤的耐受力增强，表现为肝细胞活力增强，细胞死亡率降低，说明Turrapubin？D预处理能够减轻人肝细胞缺血再灌注损伤，起到肝细胞保护作用，可以进一步研究开发成制备保护肝脏的药物。
【IPC分类】A61K31/343, A61P1/16
【公开号】CN105055397
【申请号】CN201510556638
【发明人】林天样
【申请人】林天样
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月5日