一种六味地黄丸的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种六味地黄丸的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 六味地黄丸记载于卫生部标准，由熟地黄120g、山茱萸60g、丹皮45g、山药60g、茯 苓45g、泽泻45g作为原料药制成，加水煎煮，制成丸剂。滋阴补肾。用于肾阴亏损，头晕耳 鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精。现有技术中，尚未有六味地黄丸在提取制备方面采用树 脂技术的报道，而采用水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便 服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0003] 发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种六味地黄丸的制备方 法。
[0004] 本发明的另一个目的在于提供一种六味地黄丸在制备抑制小鼠胚胎成纤维细胞 NIH3T3增殖药物中的应用。
[0005] 技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：
[0006] -种六味地黄丸的制备方法，由熟地黄120g、山茱萸60g、丹皮45g、山药60g、茯苓 45g、泽泻45g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成：取熟地黄120g、山茱萸60g、丹 皮45g、山药60g、茯苓45g、泽泻45g，加8倍量蒸馏水提取两次，每次1. 5小时，合并提取液， 浓缩至0. 4ml/g生药，加乙醇使含醇量达80 %，静置8小时，抽滤，取上清液，药液过D1010 型大孔吸附树脂柱，水洗至无色，用90%乙醇洗脱，收集洗脱液10BV，蒸干即得A部位；将过 大孔树脂后的水洗液浓缩，药液调节pH值至2后上732型阳离子交换树脂，水洗至无色，用 含3%氨水的40 %乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干即得B部位；最后将过阳离子树脂的水洗液 浓缩，调节pH值至8后上717型阴离子交换树脂，水洗至无色，浓盐酸解吸附后用40%乙醇 洗脱，收集洗脱液，蒸干即得C部位，最后将三部分粉末混合均匀，制丸，干燥，打光，每8丸 重 1. 2g。
[0007] 所述六味地黄丸在制备抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖药物中的应用，所 述的方法由下列步骤组成：取熟地黄120g、山茱萸60g、丹皮45g、山药60g、茯苓45g、泽泻 45g，加8倍量蒸馏水提取两次，每次1. 5小时，合并提取液，浓缩至0. 4ml/g生药，加乙醇使 含醇量达80%，静置8小时，抽滤，取上清液，药液过D1010型大孔吸附树脂柱，水洗至无色， 用90%乙醇洗脱，收集洗脱液10BV，蒸干即得A部位；将过大孔树脂后的水洗液浓缩，药液 调节pH值至2后上732型阳离子交换树脂，水洗至无色，用含3%氨水的40%乙醇洗脱，收 集洗脱液，蒸干即得B部位；最后将过阳离子树脂的水洗液浓缩，调节pH值至8后上717型 阴离子交换树脂，水洗至无色，浓盐酸解吸附后用40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干即得C 部位，最后将三部分粉末混合均匀，制丸，干燥，打光，每8丸重1. 2g。
[0008] 现有技术中，原六味地黄丸每8丸重1. 44g，一次8丸，一日3次，采用本发明制备 成的六味地黄丸每8丸重1. 2g，但其含有的活性成分大大增加。
【具体实施方式】
[0009] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0010] 实施例1 :取熟地黄120g、山茱萸60g、丹皮45g、山药60g、茯苳45g、泽泻45g，加8 倍量蒸馏水提取两次，每次1. 5小时，合并提取液，浓缩至0. 4ml/g生药，加乙醇使含醇量达 80 %，静置8小时，抽滤，取上清液，药液过D1010型大孔吸附树脂柱，水洗至无色，用90 %乙 醇洗脱，收集洗脱液10BV，蒸干即得A部位；将过大孔树脂后的水洗液浓缩，药液调节pH值 至2后上732型阳离子交换树脂，水洗至无色，用含3%氨水的40%乙醇洗脱，收集洗脱液， 蒸干即得B部位；最后将过阳离子树脂的水洗液浓缩，调节pH值至8后上717型阴离子交 换树脂，水洗至无色，浓盐酸解吸附后用40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干即得C部位，最后 将三部分粉末混合均匀，制丸，干燥，打光，每8丸重1. 2g。
[0011] 实施例2 :六味地黄丸抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖的实验研究资料
[0012] 1实验材料
[0013] 1. 1实验用细胞株：小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3,南京同仁堂药业有限责任公司 实验室细胞库，DMEM+10% FBS常规培养。
[0014] 1. 2实验药物：研究药物：本发明六味地黄丸：按实施例1方法制备。药液储液：称 取100mg六味地黄丸，溶于5ml无水乙醇中，0. 2 y m滤器过滤，500 y 1 doff管分装，_20°C 存储，同时0. 2 y m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0015] 1. 3 实验试剂：DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061Lot. No. 758137);胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0 公司批号：2010/04) ;EDTA(AMRESC0 公司批号：2009/10) penicillin G Sodium Salt (AMRESC0 公司批号：2010242); Str印tomycin Sulfate(AMRESC0公司批号：2010382);无水乙醇（南京化学试剂有限公司 批号：080310182) ;MTT(Biosharp 批号：0793) ;PBS(实验室自配）；
[0016] 1. 4实验器材：莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DM1L);可见-紫外光微孔板检 测仪（美国MD公司型号：SPECTRA MAX 190) ;C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏 净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD);纯水仪（美国Spring公司型号：S/N 020579);精 密移液器（法国吉尔森公司型号：P2);电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S); 全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密 实验设备公司型号：DHG9123A);冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号： 2001);低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000) ;0. 2ym滤器（MILLIP0RE型号： SLGP033RB) ;10cm培养皿（NEST公司）、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移 液管、Tips若干。
[0017]2实验方法：1)小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3用DMEM+10 % FBS于37°C、5 % C02进 行常规培养（l〇cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍， 加入3ml 0. 25%胰蛋白酶-0. 04% EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中 和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，lOOOrpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X 104个/ ml。2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 y 1，培养板放入细胞培养箱中 (37°C，5% C02)常规培养。3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入六味地黄丸 溶液，继续培养24h。4) 24h后加入20 y 1 MTT溶液（5mg/ml，即0. 5 % MTT)，继续培养4h。 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200 y 1二甲基亚砜，置摇床上低速 振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时 设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、 二甲基亚砜），每组设定6个复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率 (% )=(对照孔0D值-给药孔0D值）/对照孔0D值X 100%。实验重复3次。
[0018] 3实验结果：MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对 小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖抑制有差异（P〈0. 05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著 性（P〈0. 01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0019] 表1六味地黄丸对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖抑制影响研究（X土 SD)
[0020]
[0021] 注：与对照组比较，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0022] 4实验结论：六味地黄丸可以抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖，减少小鼠胚 胎成纤维细胞NIH3T3的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。
【主权项】
1. 一种六味地黄丸的制备方法，由熟地黄120g、山茱萸60g、丹皮45g、山药60g、茯苓 45g、泽泻45g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取熟地黄120g、山 茱萸60g、丹皮45g、山药60g、茯苳45g、泽泻45g，加8倍量蒸馏水提取两次，每次1. 5小时， 合并提取液，浓缩至〇. 4ml/g生药，加乙醇使含醇量达80 %，静置8小时，抽滤，取上清液，药 液过D1010型大孔吸附树脂柱，水洗至无色，用90%乙醇洗脱，收集洗脱液10BV，蒸干即得 A部位；将过大孔树脂后的水洗液浓缩，药液调节pH值至2后上732型阳离子交换树脂，水 洗至无色，用含3%氨水的40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干即得B部位；最后将过阳离子树 脂的水洗液浓缩，调节PH值至8后上717型阴离子交换树脂，水洗至无色，浓盐酸解吸附后 用40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干即得C部位，最后将三部分粉末混合均匀，制丸，干燥， 打光，每8丸重I. 2g。2. 根据权利要求1所述六味地黄丸在制备抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖药物 中的应用，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取熟地黄120g、山茱萸60g、丹皮45g、 山药60g、茯苓45g、泽泻45g，加8倍量蒸馏水提取两次，每次1. 5小时，合并提取液，浓缩 至0. 4ml/g生药，加乙醇使含醇量达80%，静置8小时，抽滤，取上清液，药液过D1010型大 孔吸附树脂柱，水洗至无色，用90 %乙醇洗脱，收集洗脱液10BV，蒸干即得A部位；将过大 孔树脂后的水洗液浓缩，药液调节pH值至2后上732型阳离子交换树脂，水洗至无色，用含 3%氨水的40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干即得B部位；最后将过阳离子树脂的水洗液浓 缩，调节PH值至8后上717型阴离子交换树脂，水洗至无色，浓盐酸解吸附后用40%乙醇洗 脱，收集洗脱液，蒸干即得C部位，最后将三部分粉末混合均匀，制丸，干燥，打光，每8丸重 I- 2g〇
【专利摘要】本发明属于中药制剂领域，具体提供一种六味地黄丸的制备方法，由熟地黄120g、山茱萸60g、丹皮45g、山药60g、茯苓45g、泽泻45g作为原料药制成，采用大孔树脂、阳离子交换树脂和阴离子交换树脂制备而成，使得含量有很大提高，用量减少，本发明还提供了六味地黄丸在制备抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖药物中的应用。
【IPC分类】A61P1/14, A61K36/8945, A61P35/00, A61K9/20
【公开号】CN105055769
【申请号】CN201510434596
【发明人】周勤文, 陈家进
【申请人】南京同仁堂药业有限责任公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月22日