1] (2)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：
[0052] 制备SDS-PAGE凝胶，所用试剂如下表：
[0053] 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳构成（ml)
[0056] (3)上样及电泳：每孔上样量为25 μ 1(蛋白含量约为20 yg)，样本两边加2 μ 1 蛋白Marker。浓缩胶恒压90V (约45min)，分离胶120V，待溴酸蓝迀移至胶的下缘时（约 90min)停止电泳。
[0057] (4)转膜：根据蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量准备合适大小的PVDF膜 和2张4层的滤纸，PVDF膜浸入甲醇作用5min后，放入转膜缓冲液中（滤纸置于转膜缓冲 液中）浸泡以备用。电泳完毕后转膜，300mA转膜1个小时。
[0058] (5)免疫反应：
[0059] A)封闭：将膜置于含5 % BSA的TBST封闭液中，水平摇床室温作用2h。
[0060] B) -抗结合：将膜放入用5% BSA配制的一抗（兔来源的P2X3#释比例1:1000， 小鼠抗β -actin单抗稀释比例1:800)中，4°C过夜，或室温平摇3h，TBST洗膜3次。
[0061] C)二抗结合：将膜用IgG-HRP二抗反应液（P2X3:抗为山羊抗兔，按1:2000溶于 封闭液，β -actin为山羊抗小鼠，按I :5000溶于封闭液）孵育，室温平摇I. 5h后，TBST洗 膜 IOminX4 次。
[0062] D)、免疫复合物的检测：膜加 ECL发光剂反应3min后，用保鲜膜包裹，置于X线暗 盒，暗室中剪大小合适X线胶片，曝光IOs~lOmin，显影、定影，
[0063] (7)半定量分析：胶片扫描后，通过Image图像分析软件分析目的条带在的光密度 值，以各组β -actin条带的光密度值标化其相应组P2Xj^蛋白表达量。
[0064] 7、统计学方法。
[0065] 应用SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果以均数土标准差（X土s)表示，各 组之间差异性采用方差分析，组间比较采用LSD法，p〈0. 05表示有显著性差异，p〈0.0 l为极 显著差异。
[0066] 二、结果。
[0067] ( -）行为学结果。
[0068] 各组大鼠造模中均未见肢体运动障碍和自残现象。造模前测定各组间机械缩足反 射阈值及热缩足反射潜伏期的基础值差异无显著性（P>〇. 05, F3i2s= 2. 15)。
[0069] 1、机械痛敏（MffT)测定结果。
[0070] 在给予糖尿病饮食4周后，糖尿病模型大鼠的机械缩足反射阈值开始降低，但与 对照组相比其降低无统计学意义（P>〇. 05);给予STZ腹腔注射后2周，糖尿病模型大鼠的 机械缩足反射阈值明显降低，与对照组相比具有显著性差异（P〈〇. 05);糖尿病模型大鼠给 予长非编码核糖核酸uc. 48+小干扰核糖核酸处理后一周，机械缩足反射阈值明显增加，与 对照相比其差异无统计学意义（P>〇. 05)，而与糖尿病模型组相比有显著性差异（p〈0. 05); 而模型+乱序小干扰处理组的与对照组之间相比有显著性差异（P〈〇. 05)，但与糖尿病模型 组相比其差异无统计学意义（P>〇. 05)(见图1)。
[0071] 2、热痛敏（TWL)测定结果。
[0072] 在给予糖尿病饮食4周后，糖尿病模型大鼠的热缩足反射阈值开始降低，但与对 照组相比其降低无统计学意义（P>〇. 05);给以STZ腹腔注射后2周，糖尿病模型大鼠组的 热缩足反射阈值明显降低，与对照组相比具有显著性差异（P〈〇. 05);糖尿病模型大鼠给予 长非编码核糖核酸uc. 48+小干扰核糖核酸处理后一周，热缩足反射阈值明显增加，与对照 组相比其差异无统计学意义（P>〇. 05)，与糖尿病模型大鼠组相比有显著性差异（p〈0. 05); 而给以模型+乱序小干扰处理组的与对照组之间相比有显著性差异（P〈〇. 05)，但与糖尿病 模型组相比其差异无统计学意义（P>〇. 05)(见图2)。
[0073] (二）逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)。
[0074] 采用凝胶成像系统软件分析P2XJ^ RT-PCR结果表明：糖尿病模型组DRG中P2X 3受体mRNA表达水平较对照组明显增加（p〈0. 01)，糖尿病模型+长非编码核糖核酸uc. 48+ 小干扰核糖核酸组与对照组之间差异无统计学意义（P>〇. 05)，而与糖尿病模型组之间差异 有统计学意义（P〈〇. 01)。糖尿病模型+乱序小干扰处理组卩213受体mRNA的表达高于对照 组（P〈〇. 01)，而与糖尿病模型组之间无显著性差异（P>〇. 05)(见图3)。
[0075] (三）蛋白印迹。
[0076] 1、蛋白印迹检测？2&蛋白表达。采用软件分析P2X3蛋白印迹结果表明：糖尿 病模型组DRG中P2X3受体表达水平较对照组明显增加（p〈0. 01);糖尿病模型+长非编码 核糖核酸uc. 48+小干扰核糖核酸组与对照组卩2&受体表达水平之间差异无统计学意义 (p>〇. 05)，而与糖尿病模型组之间差异有显著性意义（p〈0. 01)。糖尿病模型+乱序小干扰 处理组P2X3受体蛋白的表达高于对照组（p〈0. 01)，而与糖尿病模型组相比其差异无统计学 意义（ρ>0·05)(见图4)。
[0077] 2、蛋白印迹检测肿瘤坏死因子-α (TNF-α )蛋白表达。采用软件分析TNF-α蛋 白印迹结果表明：糖尿病模型组DRG中TNF-a表达水平较对照组明显增加（p〈〇. 01);糖尿 病模型+长非编码核糖核酸uc. 48+小干扰核糖核酸组与对照组TNF- a表达水平之间差异 无统计学意义（P>〇. 05)，而与糖尿病模型组之间差异有显著性意义（p〈0. 01)。糖尿病模型 +乱序小干扰处理组TNF-a蛋白的表达高于对照组（p〈0. 01)，而与糖尿病模型组相比其差 异无统计学意义（P>〇. 05)(见图5)。
[0078] 发明人研究发现注射长非编码核糖核酸uc. 48+的小干扰核糖核酸后，观察到糖 尿病大鼠的机械痛和热敏痛阈值升高，表明长非编码核糖核酸UC. 48+的小干扰核糖核酸 可降低2型糖尿病神经病理大鼠的痛行为、改善感觉神经的损伤现象。长非编码核糖核酸 uc. 48+的小干扰核糖核酸处理后同时可下调2型糖尿病大鼠背根神经节P2X3受体的表达， 降低糖尿病大鼠背根神经节细胞炎性因子一肿瘤坏死因子（TNF-a)的表达。因此，长非编 码核糖核酸uc. 48+的小干扰核糖核酸可能通过减少TNF- a的生成、降低2型糖尿病神经 病理大鼠背根神经节P2X3受体的表达、抑制背根神经节？2乂3受体介导的炎性伤害性信息传 递，减轻2型糖尿病神经病理痛大鼠的痛行为。
【主权项】
1. 长非编码核糖核酸uc. 48+小干扰核糖核酸在制备糖尿病并发神经病理痛药物中的 应用。2. 长非编码核糖核酸uc. 48+小干扰RNA在制备糖尿病并发神经损伤疾病药物中的应 用。3. 长非编码核糖核酸uc. 48+小干扰核糖核酸在制备糖尿病并发感觉神经炎性相关疾 病防治药物中的应用。4. 长非编码核糖核酸uc. 48+小干扰核糖核酸以口服、注射、含片或其它局部或全身用 药剂型药物进行上述疾病防治。
【专利摘要】长非编码核糖核酸uc.48+小干扰核糖核酸在制备糖尿病并发神经病理痛药物中的应用，实验证实NONRATT021972小干扰核糖核酸可降低背根神经节神经元P2X3受体的表达，降低糖尿病大鼠背根神经节细胞炎性因子—肿瘤坏死因子(TNF-α)的生成，抑制背根神经节的伤害性信息传递，减轻神经损伤及炎性物质的伤害剌激，减轻2型糖尿病神经病理痛大鼠的痛行为，可应用于制备糖尿病并发神经病理痛、糖尿病并发神经损伤相关疾病、糖尿病并发感觉神经炎性疾病的药物。
【IPC分类】A61P3/10, A61P25/00, A61K48/00, A61K31/713, A61P29/00
【公开号】CN105126117
【申请号】CN201510504601
【发明人】梁尚栋, 王寿玉, 吴炳, 邹丽芳, 刘双梅, 高云, 李桂林, 吴琴, 张熙, 应末凤
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月17日