专利名称：抑制smad4基因表达的小干扰rna及其编码序列与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小干扰RNA及其编码序列与应用，特别是涉及抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列在基因功能研究与其在制备肿瘤治疗性药物及抗癌药物筛选中的应用。
背景技术：
SMAD4又名DPC4，MADH4或JIP，是果蝇Mad相关基因，也是TGF-β和BMP信号通路重要的调节因子，可以同SMAD1，SMAD2，SMAD3，SMAD5等特定序列结合后活化转录，同CREBBP/EP300，MSG1(CITED1)反应元件相互作用激活靶基因。SMAD4是一种抑癌基因，其缺失可致胰腺癌、结肠直肠癌等，还可致家族性青少年息肉。经研究还发现该基因在肝细胞癌中有突变。此外，该基因对细胞间和细胞内信号转导通路具有调控作用。
RNA干扰技术(RNA interference，简称RNAi)是通过小分子双链RNA(ds RNA)特异性互补靶向基因转录本，从而诱导转录后基因沉默的一种方式。将双链RNA降解成长度为21-23nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，这些小片段会进一步介导与其同源的单链RNA降解，其结构稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期，并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降低至极低水平甚至完全“敲除”，从而产生缺失突变表型。siRNA的干预效应关键取决于其靶基因序列的选择，任一nt的错误均会导致RNAi效应的丧失，这种高度序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因静寂具有重要的药理作用。已证实，RNA干扰技术可单独或与其它现有的治疗手段一同用于突变所致的疾病，如病毒感染，还可以用于治疗肿瘤。
发明内容
本发明的目的是提供可抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA。
本发明所提供的抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一1)正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中的SEQ ID №2的双链RNA序列；2)正义链为序列表中的SEQ ID №3，反义链为序列表中的SEQ ID №4的双链RNA序列。
将上述双链RNA序列分别命名为SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2。其中，SMAD4siRNA-1的反义链与SMAD4 mRNA的385-405位置序列互补，序列表中SEQ ID №1由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №2由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；SMAD4 siRNA-2的反义链与SMAD4 mRNA的558-578位置序列互补，序列表中SEQ ID №3由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №4由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。
编码上述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA的DNA序列也属于本发明的保护范围。它具有下述双链核苷酸序列之一1)SMAD4siRNA-1编码序列的正义链(不做模板的DNA链)具有序列表SEQ ID №5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中SEQ ID №6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；2)SMAD4siRNA-2编码序列的正义链具有序列表SEQ ID №7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID №8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中SEQ ID №5由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №6由21个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端；序列表中SEQ ID №7由21个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID №8由21个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。
含有上述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA编码序列的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增上述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA编码序列中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。
本发明提供了抑制SMAD4基因表达的siRNA双链序列，实验证明所提供的siRNA可以有效抑制SMAD4基因的表达。本发明可用于SMAD4及TGF-β信号通路的功能研究，以及胰腺癌等恶性肿瘤的发生、发展机理的研究，并将在抗肿瘤药物的制备及抗癌药物的筛选中具有较大的实际用途。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
说明书附1为转染SMAD4 siRNA后细胞内SMAD4基因表达情况的Western Blot检测结果图2为MTT法检测瞬时表达SMAD4 siRNA对BEP2D细胞增殖影响的结果图3为MTT法检测TGF-β1对瞬时表达SMAD4 siRNA的BEP2D细胞的生长抑制效应的结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的SMAD4 siRNA均为化学合成的siRNA，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。转染时所用浓度为20nmol/L。
实施例1、抑制SMAD4基因表达的siRNA的设计及合成。
根据人SMAD4基因(GenBank号为BT009739.1)的mRNA序列，借助Ambion公司在网上提供的siRNA工具软件设计其siRNA序列，得到两条双链RNA序列，分别命名为SMAD4 siRNA-1、SMAD4 siRNA-2，序列如下SMAD4 siRNA-1正义链5’-aauccauaucacuacguucga-3’(序列表中SEQ ID №1)反义链5’-ucgaacguagugauauggauu-3’(序列表中SEQ ID №2)；SMAD4siRNA-2正义链5’-aaguaaucgugcaucgacaga-3’(序列表中SEQ ID №3)反义链5’-ucugucgaugcacgauuacuu-3’(序列表中SEQ ID №4)。
实施例2、检测SMAD4 siRNA-1、SMAD4 siRNA-2对SMAD4基因的抑制作用及对TGF-β1刺激的反应性变化。
用美国Invitrogen公司的LipofectamineTM2000试剂盒并参照试剂盒操作指南将化学合成的SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2分别转染永生化人支气管上皮细胞BEP2D细胞中，用下述方法检测转染细胞中SMAD4基因的表达情况一、Western blot检测提取上述转染细胞的总蛋白，以转染GFP siRNA的BEP2D细胞为阴性对照，用Western blot法检测转染细胞中SMAD4基因的表达情况，所用抗体为鼠抗SMAD4单克隆抗体，购自Santa Cruz公司，并以同一张膜上重复杂交鼠抗ACTIN单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)作为对照，检测结果如
图1所示(泳道1为转染GFP siRNA的阴性对照组，泳道2为SMAD4 siRNA-1转染组，泳道3为SMAD4 siRNA-2转染组)，同对照相比，转染SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2的细胞内SMAD4蛋白的表达水平均降低至检测水平以下，表明SMAD4 siRNA-1和SMAD4 siRNA-2可有效抑制SMAD4基因的表达。
二、MTT检测SMAD4沉默后细胞生长增殖能力变化及对TGF-β1刺激的反应性变化情况用MTT检测步骤获得SMAD4沉默细胞的生长增殖能力变化及对TGF-β1刺激的反应性变化情况，具体方法为将指数生长期的BEP2D细胞分别按每孔5×104接种于96孔板中，细胞分6组对照组(转染GFP siRNA)、转染Smad4 siRNA-1组、转染Smad4siRNA-2组、2ng/mL TGF-β1作用的对照组、2ng/mL TGF-β1作用的Smad4 siRNA-1转染组及2ng/mL TGF-β1作用的Smad4 siRNA-2转染组。接种的细胞在18-24h后用脂质体转染法分别转染GFPsiRNA，Smad4 siRNA-1和Smad4 siRNA-2(转染试剂Lipofectamine 2000，Invitrogen)，转染后24h在后3组加入2ng/mL的TGF-β1，作用48h后换液加入MTT进行检测，瞬时表达SMAD4 siRNA对BEP2D细胞增殖影响的检测结果如图2所示，表明SMAD4基因沉默后，细胞增殖能力增强。TGF-β1对瞬时表达SMAD4 siRNA的BEP2D细胞的生长抑制效应的检测结果如图3所示，表明SMAD4基因沉默细胞可以拮抗TGF-β1对细胞的生长抑制效应。
序列表<160>8<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aauccauauc acuacguucg a21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ucguucguagu gauauggau u21<210>3<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aaguaaucgu gcaucgacag a21<210>4<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ucugucgaugc acgauuacu u21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5aatccatatc actacgaacg a21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6ttaggtatag tgatgcttgc t21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7aagtaatcgt gcatcgacag a21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8ttcattagca cgtagctgtc t2权利要求
1.抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一1)正义链为序列表中的SEQ ID No1，反义链为序列表中的SEQ ID No2的双链RNA序列；2)正义链为序列表中的SEQ ID No3，反义链为序列表中的SEQ ID No4的双链RNA序列。
2.权利要求1所述的抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA的编码序列。
3.根据权利要求2所述的编码序列，其特征在于所述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA的编码序列是下述双链核苷酸序列之一1)正义链具有序列表SEQ ID No5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID No6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列2)正义链具有序列表SEQ ID No7的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ ID No8的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的编码序列，其特征在于所述抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA的编码序列是下述双链核苷酸序列之一1)正义链具有序列表SEQ ID No5的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ IDNo6的核苷酸序列；2)正义链具有序列表SEQ ID No7的核苷酸序列；反义链具有序列表中SEQ IDNo8的核苷酸序列。
5.权利要求1所述的抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA在制备肿瘤治疗性药物及抗癌药物筛选中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述肿瘤为胰腺肿瘤。
全文摘要
本发明公开了抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列与应用，其目的是提供抑制SMAD4基因表达的小干扰RNA及其编码序列与其在基因功能研究及制备肿瘤治疗性药物和抗癌药物筛选中的应用。该小干扰RNA，是下述双链RNA序列之一1)正义链为序列表中的SEQ ID №1，反义链为序列表中的SEQ ID №2的双链RNA序列；2)正义链为序列表中的SEQ ID №3，反义链为序列表中的SEQ ID №4的双链RNA序列。本发明可用于SMAD4及TGF－β信号通路的功能研究，以及胰腺癌等恶性肿瘤的发生、发展机理研究，并将在抗肿瘤药物的制备及抗癌药物的筛选中具有较大的实际用途。
文档编号C12N15/11GK1803823SQ200610000499
公开日2006年7月19日 申请日期2006年1月5日 优先权日2006年1月5日
发明者霍艳英, 胡迎春, 李刚, 何欣蓉, 吴德昌 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所