: 1)显示HC1* Arg(Tos)-Gly-Asp (OBzl)-Phe-OBzl消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物依次用乙醚 (20mL X 3)，20mL KHSO4水溶液（5 % )和H2O (20mL X 3)研磨，得到的固体经37。。真空干燥48 小时重599mg，为淡黄色。直接用于下一步反应。
[0051] 实施例4制备聚天冬酰-Arg-Gly-Asp-Phe (聚天冬酰-RGDF)
[0052]冰浴下将599mg聚天冬醜-Arg (Tos) -Gly-Asp- (OBzl) -Phe-OBzl溶于5mL三氟乙 酸，往得到的溶液中加入2mL三氟甲磺酸，搅拌90分钟。反应混合物用乙醚洗（150mLX 3)， 残留物溶于50mL水，用NaOH水溶液（2N)调pH7。得到的混浊液离心30分钟，上层清液用孔 径为5000的透析膜透析72小时，截留的残留物冷冻干燥，得174mg (43% )聚天冬酰-RGDF， 为乳白色固体。[a ]D25 = -21. 6(C = 0? 01，H20)。13CNMR(125MHz，CDCl3)d/ppm = 177. 33， 171. 92,170. 50,170. 07,156. 79,138. 48,137. 48,129. 79,129. 43,128. 56,126. 84,60. 52, 56. 21,53. 66,53. 09,51. 25,42. 43,40. 58,38. 83,37. 63,27. 96,24. 32。按照数均聚合度为 173计算，聚天冬酰-RGDF的分子量为96231。
[0053] 实施例5测定聚天冬酰-RGDF的抗血小板聚集活性
[0054] 1)制备2 X IO8血小板/mL血浆
[0055] 用1 %的硅醚溶液将采血容器硅烷化。在硅烷化的容器中收集猪血，按照猪血：抗 凝剂9 : 1 (体积比）加入枸橼酸钠（3. 8% )抗凝，水平缓慢晃匀。将抗凝的猪血在120g 离心10分钟，得到的上清液即是富血小板血浆（PRP)。残留的猪血继续在1500g离心10分 钟，得到的上清液即是贫血小板血浆（PPP)。光学显微镜下观察，用PPP调PRP使血小板数 目为2 X IO8血小板/mL血浆。
[0056] 2)测定聚天冬酰-RGDF的抗血小板聚集活性（IC50)
[0057] 在血小板聚集分析仪测量管内加入240 y L PRP，轻微搅拌下37°C温育10分钟，调 零。大约1分钟后加入5 ii L生理盐水（空白对照）或西洛他唑的生理盐水溶液（阳性对照， 终浓度为ImM)或聚天冬酰-RGDF的生理盐水溶液（终浓度为0. 01，0. 1，1. 0,10,100 ii M)。 大约1分钟后加入5 ii L ADP的生理盐水溶液（终浓度为500 ii M)或PAF的生理盐水溶液 (终浓度为50 ii M)或AA的生理盐水溶液（终浓度为7. 5mg/mL)或TE的生理盐水溶液（终 浓度为50U/mL)。待浊度从100下降进入平台期，记录约6分钟的稳定曲线为最大聚集率， 计算各种浓度下聚天冬酰-RGDF对血小板聚集的抑制率。每个浓度平行测6次，求平均值。 计算式为抑制率％=(生理盐水存在下的血小板聚集率-聚天冬酰-RGDF存在下的血小板 聚集率）/生理盐水存在下的血小板聚集率。按照5种浓度聚天冬酰-RGDF存在下血小板 聚集的抑制率，计算IC5。值。用IC5。表示活性，结果见表1。
[0058] 表1聚天冬酰-RGDF对ADP，PAF，AA和TH诱导的血小板聚集的影响（n = 6) *
[0059]
[0060]
[0061] *聚天冬氨酸未测出抗血小板聚集活性.
[0062] 表1的数据说明，与RGDF相比聚天冬酰-RGDF抑制ADP，PAF，AA和TE诱导的血 小板聚集的活性分别高7,408,80和80倍。可见将RGDF连接到聚天冬氨酸上，大大提高了 RGDF的抗血小板聚集活性。
[0063] 实施例6测定聚天冬酰-RGDF对GPIIb/IIIa的抑制作用
[0064] 1)制备聚天冬酰-RGDF处理的活化血小板样品
[0065] 雄性SD大鼠（220~230g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦水溶液使麻醉。在 硅烷化的容器中收集大鼠动脉血，加1/9体积的枸橼酸钠（3. 8% )抗凝，水平缓慢晃匀， 120g离心10分钟，取上清液，得到PRP血浆。向96 ii L血浆中加入2 ii L聚天冬酰-RGDF 的生理盐水溶液（终浓度50nM)，孵育5分钟，加2 ii L AA的生理盐水溶液（终浓度7. 5mg/ mL)，37°C温育3分钟。
[0066] 2)测定聚天冬酰-RGDF对GPIIb/IIIa抑制作用
[0067] 按照GPIIb/IIIa ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）的标准方法，96孔 板室温平衡20分钟，设置标准品孔和聚天冬酰-RGDF孔。绘制标准曲线用的标准品孔先 加50 ii L试剂盒的标准溶液（终浓度为1600,800,400, 200,100和Ong/mL)，再加IOOiiL 辣根过氧化物酶标记的检测抗体。聚天冬酰-RGDV孔先加96 ii L PRP血浆和10 ii L聚天冬 酰-RGDV的生理盐水溶液（终浓度50nM)，37 °C孵育5分钟，再加2 ii L AA的生理盐水溶液 (终浓度7. 5mg/mL)，37°C温育3分钟，后加40 ii L试剂盒的样本稀释液。RGDF孔先加96 ii L PRP血浆和10 U L RGDF的生理盐水溶液（终浓度25mM)，37°C孵育5分钟，再加2 ii L AA的 生理盐水溶液（终浓度7. 5mg/mL)，37°C温育3分钟，后加40 ii L试剂盒的样本稀释液。空 白孔孔先加96 ii L PRP血浆和10 ii L生理盐水，37 °C孵育5分钟，再加2 ii L AA的生理盐水 溶液（终浓度7. 5mg/mL)，37°C温育3分钟，再加40 ii L试剂盒的样本稀释液，后加100 ii L 试剂盒的辣根过氧化物酶标记的检测抗体。96孔板用封板膜封孔，37°C孵育60分钟。每个 孔重复3次。
[0068] 3)洗板/显色和测定
[0069] 各孔弃去溶液后在吸水纸上拍干，加满试剂盒的洗涤液，静置1分钟。甩去洗涤液 后在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。各孔加入50 ii L试剂盒的底物A和50 ii L试剂盒 的底物B，37°C避光孵育15分钟。向各孔加50 ii L试剂盒的终止液，15分钟内在450nm波 长处测定各孔的OD值。根据标准曲线计算GPIIb/IIIa的量，结果见表2。可见将RGDF连 接到聚天冬氨酸上，大大提高了RGDF抑制GPIIb/IIIa的活性。
[0070] 表2聚天冬酰-RGDF对GPIIb/IIIa抑制作用*
[0071]
[0072] *聚天冬酰-RGDF的浓度为IiiM，RGDF的浓度为2. 5mM，n= 3.a)与NS组比p < 0. 05.
[0073] 表2的数据说明，聚天冬酰-RGDF可有效地抑制GPIIb/IIla。与RGDF相比聚天冬 酰-RGDF抑制AA活性的血小板上GPIIb/IIIa的活性是RGDF的2500倍。可见将RGDF连 接到聚天冬氨酸上，大大提高了RGDF对GPIIb/IIIa的抑制活性。
[0074] 实施例7测定聚天冬酰-RGDV的抗血栓活性
[0075] 1)给药
[0076]雄性SD大鼠（220~230g)分别口服生理盐水（3ml/kg)，阿斯匹林的生理盐水溶 液（167iimol/kg)，聚天冬酰-RGDF的生理盐水溶液（lnmol/kg)，以及聚天冬氨酸（lnmol/ kg)和RGDF(lnmol/kg)的混合物的生理盐水溶液。各10只大鼠，30分钟之后进行下面的 手术。
[0077] 2)大鼠手术与插管
[0078] 雄性SD大鼠（220~230g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻 醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术 线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。
[0079] 插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段。中段为聚乙烯胶管，长6cm，内径3. 5mm。 另外两段聚乙烯管，长10cm，内径I. 0mm，外径2. 0mm。它们的一端拉成外径为I.Omm的尖管 (用于插入大鼠颈动脉或静脉）。将编好号的干净青霉素小瓶中分别装入6cm长的硅烷化 黑色手术线，称重，放入中段插管中。
[0080] 打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液（50IU/ kg)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠体内。夹 闭右侧颈动脉夹，将插管的静脉端插入分离好的大鼠左侧颈静脉，打开动脉夹，使血液开始 循环。并同时开始计时15分钟。
[0081] 3)血栓称重
[0082] 15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸 掉血滴，放入事先称重好的青霉素小瓶中，精确称重并记录，计算的血栓湿重代表活性，结 果见表3。
[0083] 表3聚天冬酰-RGDF对在大鼠血栓形成的影响*
[0086] *n= 10 ;a)与生理盐水和聚天冬氨酸+RGDV比P<0.01，与阿司匹林比p>0.05 ; b)与生理盐水比p> 0.05.
[0087] 表3的数据说明，聚天冬酰-RGDF可有效地抑制大鼠形成血栓。与阿司匹林相比 聚天冬酰-RGDF的活性是阿司匹林的167000倍。可见将RGDF连接到聚天冬氨酸上，大大 提高了RGDF对大鼠形成血栓的抑制活性。
[0088] 实施例7测定聚天冬酰-RGDF的血栓靶向作用
[0089] 收集实施例6中接受聚天冬酰-RGDF治疗的大鼠的500mg血液加ImL枸橼酸钠 的水溶液（3. 8% )抗凝，4°C和3000g离心10分钟，上清液与2mL甲醇充分混合，于4°C和 12000g离心10分钟，取10iiL进样测定FT-MS。在血液提取物的质谱图中没有发现任何与 聚天冬酰-RGDF相关的峰（图2上）。测定结果说明，聚天冬酰-RGDF从血液中快速向血栓 形成部位转移、在血液中不释放RGDF、不代谢。
[0090] 收集实施例6中接受聚天冬酰-RGDF治疗的大鼠插管中的50mg血栓先用2mL高 纯水洗，然后用2mL高纯水制备匀浆。得到的匀浆于4°C和3000g离心10分钟，上清液与 2mL甲醇充分混合，于4°C和12000g离心10分钟，取10iiL进样测定FT-MS。在血栓提取物 的质谱图中看到RGDF加H的峰（987. 35746,图2左下）和RGDF加Na的峰（1009. 87493， 图2右下）。测定结果说明，聚天冬酰-RGDF进入血栓之后，释放RGDF，抑制大鼠血栓形成。 可见，聚天冬酰-RGDF具有血栓靶向作用。
【主权项】
1. 血栓靶向释放RGDF的抗血栓剂聚天冬氨酰-RGDF。2. 所述聚天冬氨酰-RGDF的聚天冬酰的聚合度为173。3. 制备权利要求1所述聚天冬氨酰-RGDF的方法，该方法包括下面四个步骤。 (1) 采用液相合成方法逐步接肽，合成HCl?Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl; (2) 聚合度为173的聚天冬氨酸的制备方法； (3) 把HCl.Arg(T0s)-Gly-Asp(OBzI)-Phe-OBzI连接到聚合度为173的聚天冬氨酸的 侧链羧基上，制备聚天冬酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl; (4) 脱去聚天冬氨酰-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的保护基。4. 所述聚天冬氨酰-RGDF的抗血栓作用。5. 所述聚天冬氨酰-RGDF在制备抗血栓药物中的用途。
【专利摘要】本发明涉及血栓靶向释放RGDF的聚天冬酰-RGDF，涉及它的制备方法，涉及它在大鼠血栓模型上的靶向抗血栓作用。因而本发明阐明了聚天冬酰-RGDF作为靶向抗血栓剂的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。
【IPC分类】A61P7/02, A61K38/07, C08G73/10, A61K47/48
【公开号】CN105194682
【申请号】CN201410272954
【发明人】赵明, 彭师奇, 王玉记, 吴建辉, 陈双玲
【申请人】首都医科大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年6月19日