一种深层发酵竹荪菌丝体的制备及其在化妆品中的应用_2

文档序号:9496207阅读:来源:国知局
产,商品名:马铃薯葡萄糖肉 汤)粉末35-45g溶于1L水中灭菌后即得(PDA摇瓶)。
[0037] ③发酵培养基(g/L):玉米粉25_35g,葡萄糖15_25g,七水硫酸镁0· 5-1. 5g,磷酸 二氢钾 1. 0-3. 0g,维生素B1 (5-15)X10 3g,自然pH。
[0038] 菌丝体培养方法如下:
[0039] ①斜面培养:
[0040] 取母菌种菌丝块接种于PDA培养基上,25-30°C避光培养(LRH-250生化培养箱:上 海一恒科技有限公司)待菌丝长满斜面,取出保存待用(说明:菌丝体的培养温度对于湿度 没有严格的控制,只要普通的生化培养箱即可,正常的培养温度为26°C)。
[0041] ②液体种子培养:
[0042] 将已活化的斜面菌种接种于装有50-150ml液体种子培养液的250ml三角瓶中,摇 床(DKY-II回转式恒温调速摇床柜:上海杜科自动化设备有限公司)培养(80-120r/min, 25-30°C)10-14天,制得一级种子液,然后将一级种子液按接种量8-12%接到液体种子培 养基中,在相同的培养条件下制备二级种子液。
[0043]③发酵液培养:
[0044]以二级或三级种为种子液,接种量8-12 %,接种于装有150_250ml发酵培养液的 500ml三角瓶中,摇床培养(80-120r/min,25-30°C)5-14 天。
[0045] 竹荪菌丝体提取物的制备:
[0046] 取竹荪菌丝体与蒸馏水按照一定的料液比混合,采用超声法及高温水提法经过离 心,去除沉淀,得到的上清液即为竹荪菌丝体提取物。在竹荪菌丝体提取物的制备过程中, 竹荪菌丝体与蒸馏水的料液比为1:10至1:1〇〇。在一个具体的实施方式中,竹荪菌丝体与 蒸馏水的料液比为1:10至1:50。例如,在一个较优选的实施方式中,竹荪菌丝体与蒸馏水 的料液比为1:30。在一个实施方式中,高温水提法包括在60~90°C水浴锅中浸提约4~ 6小时。
[0047] 在一个实施方式中,竹荪菌丝体提取物的使用浓度可以是0.l_50mg/ml。例如, 竹荪菌丝体提取物的使用浓度可以是〇.l-20mg/ml,例如0. 1-lOmg/ml,例如0.l-5mg/ml, 例如0.l-3mg/ml,例如0. 1-lmg/ml。在一个实施方式中,竹荪菌丝体提取物的使用浓度为 0· 5mg/ml〇
[0048] 可以将竹荪菌丝体提取物按照0. 001-100重量%的比例添加到化妆品组合物中。 例如,化妆品组合物中竹荪菌丝体提取物的用量可以是0. 01-50重量%,例如0. 01-30重 量%,例如0. 01-20重量%,例如0. 01-10重量%,例如0. 01-5重量%,例如0. 01-3重量%, 例如0. 01-1重量%。在其他实施方式中,化妆品组合物中竹荪菌丝体提取物的用量可以是 0· 5-20 重量%,例如,0· 5-10 重量%,0· 5-5 重量%,0· 5-3 重量%,0· 5-2 重量%,0· 5-1 重 量%。
[0049] 下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是,应该明白,这些实施例仅用于说 明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常 按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明,所有的百分比和份数按重量 计。
[0050] 实施例1:竹荪菌丝体及竹荪菌丝体提取物的制备
[0051] 菌株:竹郝DictyophoraduplicataACCC4912,来自中国微生物菌种保藏管理委 员会农业微生物中心上海食用菌分中心。
[0052]培养基:
[0053] -斜面培养基(PDA斜面):以商品名马铃薯葡萄糖琼脂购自美国BD公司,具体制 备过程包括将马铃薯葡萄糖琼脂粉末39g溶于1L去离子水中,灭菌后即得。
[0054] -种子培养基:以商品名马铃薯葡萄糖肉汤购自美国BD公司,具体制备过程包括 将马铃薯葡萄糖粉末40g溶于1L水中,灭菌后即得(PDA摇瓶)。
[0055] -发酵培养基:具体制备过程包括将玉米粉30g,葡萄糖20g,七水硫酸镁1. 0g,磷 酸二氢钾2. 0g,维生素BIO.Olg溶于1L去离子水中。
[0056] 菌丝体的培养:
[0057]-斜面培养
[0058] 取竹荪菌株的菌丝块接种于斜面培养基上,26°C避光培养((LRH-250生化培养 箱:上海一恒科技有限公司),待菌丝长满斜面,取出保存待用。
[0059]-液体种子培养
[0060] 将已活化的斜面菌种接种于装有80ml液体种子培养液的250ml三角瓶中,摇床培 养(120r/min,26°C)10天((DKY-II回转式恒温调速摇床柜:上海杜科自动化设备有限公 司),制得一级种子液,然后将一级种子液按接种量8%接到液体种子培养基中,在相同的 培养条件下制备二级种子液。以类似的方法制备三级种子液。
[0061]--发酵液培养:
[0062] 取二级或三级种子液,接种量8%,接种于装有200ml发酵培养液的500ml三角瓶 中,摇床培养(120r/min,26°C)7天。
[0063] 培养7天后,最终得到竹荪菌丝体7. 61g。
[0064] 竹荪菌丝体提取物的制备:
[0065] 将竹荪菌丝体与蒸馏水以1:30(重量比)的料液比混合,逐步采用超声提取、高温 水提的方法进行制备。具体是采用KQ-600B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司), 超声时间30分钟,温度40~60°C,对竹荪菌丝体进行超声提取。然后,将超声后的混合物 在60~90°C水浴锅中浸提约4~6小时,取出离心(离心机:BeckmanCoulterAllegra ?25RCentrifuge,离心转速:10000rpm),弃沉淀,取出上清液即为竹郝菌丝体提取物。该 上清液冻干成粉末后重新溶解在蒸馏水中,制得的该提取物的生药浓度为〇. 〇5g/ml。
[0066] 实施例2:面霜的制备
[0067]
[0068] 实施例3 :乳液的制备
[0069]
[0070]





[0092]以上2-12实施例中所述的竹荪菌丝体组合物均经过①稳定性测试,将料体分别 在-20°C、4°C、室温、48°C、循环(连续变换四个温度条件)放置12周,各料体的颜色和形 态都保持稳定;②皮肤安全性测试,证实对皮肤无刺激,不会引发红斑、脱屑、刺痛及灼热等 不良反应,可安心使用;③使用感觉测试,请20位中国女性志愿者在面部连续使用实施例 9所述的精华液8周评估结果表明,使用含竹荪菌丝体提取物的精华液后,明显发现肌肤变 得白皙、通透度提升,感觉肌肤水嫩饱满度提高,显得更为年轻。
[0093]以下实施例13-14中所使用的竹荪菌丝体提取物样品溶液为实施例1制备得到的 竹荪菌丝体提取物;以下试验例中涉及的"mg/ml"浓度单位,为生药浓度。
[0094] 实施例13:竹荪菌丝体提取物美白功效评估
[0095] 一、实验原理
[0096]为了验证竹荪菌丝体提取物的美白功效,我们利用角质细胞与黑素细胞共培养体 系对其美白功效进行评估。在该培养体系中,角质细胞和黑色素细胞模拟正常皮肤中两种 细胞的比例共同培养。如果待测物能够减少黑色素总量的生成,可认为其具有皮肤美白的 功效。该共培养体系的优势在于,它不仅可以通过测定黑色素生成的量直接判定待测物质 的美白功效,而且还可以初步研究待测物质的美白机理。该评估方法由三个独立的实验组 成。首先是黑色素生成总量检测,将黑色素颗粒溶解于高温碱性溶液,利用其在405nm处有 较大光吸收,来间接反映黑色素颗粒生成量。其次是细胞酪氨酸酶实验,相比较体外生化酪 氨酸酶活性抑制实验该测试方法更能反映出真实结果。最后一个实验是D0PA染色,通过 D0PA染色可以观察到共培养体系中的黑色素细胞的形态、数量,通过衡量黑色素细胞染色 深度也可以反映出待测物质的美白功效。
[0097] 另一方面,为了验证竹荪菌丝体提取物的抗衰老功效,我们利用角质细胞对其抗 衰老功效进行评估。皮肤衰老的一个显著特征是其表皮层逐渐变薄,这主要是由于角质细 胞活力降低、增殖速度下降所导致,如果待测物能够增强角质细胞活力,可初步判定其具有 抗衰老的功效。
[0098] 二、实验方法
[0099](一)美白功效检测
[0100] 1、细胞培养
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