及药物处理
[0101] 将制备好的角质细胞（Hacat细胞）及黑素细胞（B16细胞）以22:1的比例接种 于6孔细胞板内（设置空白孔，空白孔中仅加入相应浓度的Hacat细胞）。24小时后，阴 性对照组每孔加入2ml新鲜的培养液，样品组每孔加入2ml相应浓度的竹荪菌丝体提取物 样品溶液（培养液配制），〇. 2mg/ml的曲酸作为阳性对照，每组设3个复孔，置C02培养箱 (37°C，5%C02)中孵育。48小时后进行第二次加样，每孔加入2ml溶液，方法同上。再次孵 育48小时后进行第三次加样，每孔加入2ml溶液，方法同上。第三次加样24小时后，消化 收集各组细胞，离心，弃去上清液。
[0102] 2、黑色素含量检测
[0103]收集到的细胞中加入200μ1的黑色素提取液（lmol/LNa0H+10%DMS0)，吹打均 匀，95°C水浴1小时。待冷却，适度离心下管壁液滴，吹打均匀，吸取各离心管中的150μ1 溶液，移入96孔板中，酶标仪检测各孔Abs405值。
[0104] 计算对黑色素生成的抑制率
[0105] 式中：T-样品孔Abs;C-阴性对照孔Abs;C。-空白孔Abs。
[0106] 3、细胞酪氨酸酶活性检测
[0107] 收集到的细胞中加入400μ11%Triton溶液，充分震荡后，4°C反应1小时。 4000rpm离心5分钟。在1. 5mleppendorf管中各加入100μ13mg/ml多巴溶液，吸出每个 离心管中200μ 1上清液，37°C孵育2小时。吸取各离心管中的150μ 1溶液，移入96孔板 中，酶标仪检测各孔Abs405值。
[0108] 计算对黑色素生成的抑制率：
[0109] 式中：T-样品孔Abs;C-阴性对照孔Abs;C。-空白孔Abs。
[0110] 4、D0PA染色
[0111] 吸去细胞培养液，用PBS洗两遍。加入10%甲醛，室温固定15分钟。PBS洗净后， 加入lmg/ml的多巴溶液，37°C孵育1小时，观察细胞内酪氨酸酶与多巴的反应。染色结束 后，吸去多巴溶液，加入PBS，在显微镜下观察黑素细胞的多巴染色结果，拍照。
[0112] 5、结果判定
[0113] 根据405nm处测得的吸光值来判定样品是否具有美白效果。
[0114] 在黑素检测实验中，样品组0D值小于阴性对照组，且相对于阴性对照组有显著性 差异则表明样品有抑制黑素生成的效果。
[0115] 在细胞酪氨酸酶活性检测实验中，样品组0D值小于阴性对照组，且相对于阴性对 照组有显著性差异则表明样品有抑制酪氨酸酶的效果。
[0116] 在D0PA染色实验中，在没有观测到黑色素细胞数量减少，形态发生明显变化的同 时，如果样品组黑色素细胞染色结果比对照组浅，说明样品具有较高的安全性，样品的美白 功效并不是通过杀死黑色素细胞或抑制黑色素细胞生长来达成的。
[0117] (二）抗衰老功效检测
[0118] 1、细胞培养及药物处理
[0119] 将制备好的角质细胞（Hacat细胞）接种于96孔细胞板内。24小时后，阴性对照 组每孔加入150μ1新鲜的培养液，样品组每孔加入150μ1相应浓度的竹荪菌丝体提取物 样品溶液，HB-EGF作为阳性对照，每组设6个复孔，置C02培养箱（37°C，5%C02)中孵育。 48小时后进行第二次加样，方法同上。一共加样72小时后，进行细胞活力检测。
[0120] 2、细胞活力检测
[0121] 采用XTT法检测细胞线粒体活力，首先用60°C预热的培养液将XTT配制成1.Omg/ ml溶液，然后用PBS将PMS配制成5mmol/l溶液，临用时，将PMS与lmg/ml的XTT按1:200 比例混合，用细胞培养液将lmg/mlXTT/PMS溶液稀释至0. 2mg/ml，最后移除96孔板中培养 液，加入0. 2mg/mlXTT/PMS溶液，37°C孵育2小时，在酶标仪上450nm处测定吸光度。
[0122] 3、结果判定
[0123] 根据450nm处测得的吸光值来判定样品是否具有抗衰老效果。
[0124] 在角质细胞活力检测实验中，样品组0D值大于阴性对照组，且相对于阴性对照组 有显著性差异，因此表明样品具有增强细胞活力的作用，从而说明样品具有抗衰老的功效。
[0125] 三、实验结果
[0126] 1、竹荪菌丝体提取物抑制黑色素细胞生成黑色素
[0127]
[0128] 如图1所示，0. 5mg/ml浓度下竹荪菌丝体提取物可以抑制黑色素的产生。
[0129] 实验结果显示，竹荪菌丝体提取物可以抑制黑色素的产生（与对照相比，其结果 具有显著差异，*P〈〇. 05)，因此具有美白的功效。
[0130] 2、竹荪菌丝体提取物抑制黑色素细胞酪氨酸酶
[0131]
[0132] 如图2所示，0· 5mg/ml浓度下竹荪菌丝体提取物可以抑制细胞酪氨酸酶。
[0133] 实验结果显示，竹荪菌丝体提取物可以抑制细胞酪氨酸酶（与对照相比，其结果 具有显著差异，*P〈〇. 05)，这说明竹荪菌丝体提取物的美白功效源自其对细胞酪氨酸酶的 抑制作用。
[0134] 3、D0PA染色结果
[0135] 如图3所示，D0PA染色后黑色素细胞呈黄褐色。经过竹荪菌丝体提取物处理后， 黑色素细胞克隆没有减少，显微镜下也没有观测到形态的改变，但是黑色素克隆的颜色明 显变淡。这个结果揭示竹荪菌丝体提取物是一个比较安全的美白剂，它并不是通过影响黑 色素细胞生长来达到美白效果。
[0136] 4、竹荪菌丝体提取物增强角质细胞活力
[0137] 如图4所示，0.5mg/ml浓度下竹荪菌丝体提取物可以显著增强角质细胞活力。
[0138] 实验结果显示，竹荪菌丝体提取物可以促进角质细胞活力（与对照相比，其结果 具有显著性差异，*P〈〇. 05)，说明竹荪菌丝体提取物具有抗衰老的功效。
【主权项】
1. 一种深层发酵竹荪菌丝体的制备方法，所述方法包括以下步骤： a. 提供竹荪菌株，所述竹荪菌株以ACCC4912来自中国微生物菌种保藏管理委员会农 业微生物中心上海食用菌分中心， b. 斜面培养， c. 液体种子培养， d. 发酵液培养，得到竹荪菌丝体。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述斜面培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养 基。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体种子培养采用马铃薯葡萄糖培养 基。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液培养采用的培养基包含玉米粉， 葡萄糖，七水硫酸镁，磷酸二氢钾，维生素B1。5. 如权利要求1所述方法制备得到的竹荪菌丝体。6. -种竹荪菌丝体提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤： a. 提供如权利要求5所述的竹荪菌丝体， b. 超声提取， c. 温度60~90°C水提4~6小时， d. 离心后，取上清液，得到竹荪菌丝体提取物。7. 如权利要求6所述的竹荪菌丝体提取物在具有美白和/或抗衰老功效的化妆品中的 应用。8. -种化妆品组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求6所述的竹荪菌丝体 提取物和化妆品领域可接受的辅料。9. 如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述辅料选自：溶剂、增溶剂、防腐剂、抗 氧剂、pH调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化 剂、推进/抛射剂、香精、色素，以及其他功效添加剂。10. 如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述化妆品组合物是选自以下的形式： 霜剂、乳剂、溶液剂、膜剂、气雾或喷雾剂。
【专利摘要】本发明公开了一种竹荪菌丝体的制备方法，该竹荪菌丝体是通过深层发酵的方法制备得到的。该竹荪菌丝体的制备方法生产周期短、生产工艺简便、培养材料易得、产品质量易于控制且成本低。用该方法制备得到的竹荪菌丝体具有美白及抗衰老功效。本发明也公开了竹荪菌丝体提取物在化妆品中的应用，以及含有竹荪菌丝体提取物的化妆品组合物。
【IPC分类】A61Q19/08, A61Q19/10, A61Q19/02, A61K8/99
【公开号】CN105250209
【申请号】CN201410345171
【发明人】冯冰, 吴越, 陈媛祺, 马来记, 冯杰, 刘艳芳, 颜梦秋
【申请人】上海家化联合股份有限公司, 上海市农业科学院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年7月18日