10，14-四甲基十五烷)给予腹膜腔。
[0073]可通过适当选自已知方法的方法，例如蛋白质A-琼脂糖方法、羟磷灰石色谱法、用硫酸盐的盐析方法、离子交换色谱法和亲和色谱法或通过综合使用所述方法，来纯化用于本发明的抗体。
[0074]本发明可使用由基因工程产生的重组抗体。从杂交瘤分离编码由上述方法获得的抗体的基因。将基因插入合适的载体中，然后导入宿主中(参见例如Carl，A.Κ.Borrebaeck， James, ff.Larrick， Therapeutic Monoclonal Antibodies, Published inthe United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd, 1990) 0 本发明提供编码本发明的抗体的核酸和包含这些核酸的载体。具体来讲，使用反转录酶，从杂交瘤的mRNA合成编码抗体可变区(V区)的cDNA。在获得编码目标抗体可变区的DNA后，将其与编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接，将所得DNA构建体插入表达载体中。或者，可将编码抗体可变区的DNA插入包含抗体C区的DNA的表达载体中。将这些插入表达载体中，使得基因在表达调节区(例如增强子和启动子)的调节下表达。然后，将宿主细胞用表达载体转化以表达抗体。本发明提供表达本发明的抗体的细胞。表达本发明的抗体的细胞包括所述抗体的基因转化的细胞和杂交瘤。
[0075]在本发明中，可使用经人工修饰以减少针对人的异质抗原性的重组抗体。实例包括嵌合抗体和人源化抗体。这些修饰的抗体可采用已知方法产生。嵌合抗体包括包含彼此不同的物种的可变区和恒定区的抗体，例如，包含非人哺乳动物(例如小鼠)的抗体重链和轻链可变区和人的抗体重链和轻链恒定区的抗体。可通过(1)将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接；(2)将其掺入表达载体中；和(3)将载体导入宿主中以产生抗体，来获得所述抗体。
[0076]通过将非人哺乳动物(例如小鼠)的抗体Η链或L链互补决定区(⑶R)用人抗体的CDR置换，获得人源化抗体，亦称重构人抗体。用于制备所述抗体的常规遗传重组技术是已知的(参见例如 Jones等，Nature 321: 522-525 (1986) ;Reichmann等，Nature 332:323-329 (1988) ；Presta Curr.0p.Struct.B1l.2: 593-596 (1992))。具体来讲，使用经构建以在其末端包含重叠部分的几个寡核苷酸，通过PCR合成所设计的使小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(FR)连接的DNA序列。可通过(1)将所得DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接；(2)将其掺入表达载体中；和(3)将载体转染进入宿主以产生抗体，获得人源化抗体(参见欧洲专利申请号EP 239，400和国际专利申请号W0 96/02576)。选出通过CDR连接的人抗体FR，其中CDR形成有利的抗原结合部位。人源化抗体可包含其它氨基酸残基，所述残基不包括在引入接受抗体中的CDR中，也不包括在构架序列中。通常引入所述氨基酸残基以更精确地使抗体识别和结合抗原的能力优化。例如，需要时，抗体可变区的构架区的氨基酸可被置换，使得重构人抗体的CDR形成合适的抗原结合部位(Sato, Κ.等，Cancer Res.(1993) 53, 851-856)。
[0077]用于获得人抗体的方法也是已知的。例如，可通过(1)体外将人淋巴细胞用目标抗原或表达目标抗原的细胞敏化；和(2)将敏化的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞(例如U266)融合，来获得所需的具有抗原结合活性的人抗体(参见已审核公布的日本专利申请号(JP-B) Hei 1-59878)。或者，还可通过使用抗原使包含部分或完整人抗体基因库的转基因(Tg)动物免疫，来获得所需的人抗体(参见Nature Genetics 7:13-21 (1994) ；NatureGenetics 15:146-156 (1997) ；Nature 368:856-859 (1994);国际专利申请W0 93/12227、W0 92/03918、W0 94/02602、W0 94/25585、W0 96/34096 和 W0 96/33735)。具体来讲，如下产生所述Tg动物:通过产生敲除动物或Tg动物或使所述动物交配，获得非人哺乳动物，其中内源免疫球蛋白重链和轻链的基因座被破坏，取而代之的是通过酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋白重链和轻链的基因座。例如，可通过在J区或C区(例如Cy区)的某个位点引入缺陷，使免疫球蛋白重链基因座在功能上失活。例如，可通过在J区或C区或包含J和C区的区域的某个位点上引入缺陷使免疫球蛋白轻链(例如κ链)在功能上失活。
[0078]还可通过采用遗传工程技术用编码抗体的每个重链和轻链的cDNA或优选包含这些cDNA的载体转化真核细胞，然后培养产生重组人单克隆抗体的转化细胞，从培养物上清液中获得所述人源化抗体。宿主为例如合乎要求的真核细胞，优选哺乳动物细胞，例如CH0细胞、淋巴细胞和骨髓瘤。
[0079]此外，通过用人抗体文库淘选获得人抗体的技术是已知的。例如，采用噬菌体展示方法，人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)在■菌体表面上表达，可选择与抗原结合的噬菌体。可通过分析所选择的噬菌体的基因，测定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果鉴定出结合抗原的scFv的DNA序列，则可构建包含这些序列的合适的表达载体，然后导入合适的宿主中，并表达得到人抗体。所述方法是本领域众所周知的(参见W0 92/01047、TO 92/20791、TO 93/06213、TO 93/11236、TO 93/19172、TO 95/01438 和 TO95/15388)o
[0080]当分离出抗体基因，并导入合适的宿主中时，可以合适的组合使用宿主和表达载体以产生抗体。作为真核宿主细胞，可使用动物细胞、植物细胞和真菌细胞。动物细胞包括:(1)哺乳动物细胞例如CH0、C0S、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、HeLa和Vero细胞；(2)两栖动物细胞例如非洲蟾蜍(Xenopus)卵母细胞；或(3)昆虫细胞例如sf9、sf21和Tn5或蚕。已知的植物细胞包括来源于可以是愈伤组织培养的烟草属iNicotianei)例如烟草{Nicotianatabacum)的细胞。已知的真菌细胞包括酵母例如酵母属，例如酿酒酵母、Saccharomyces cerevisiae)，和丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉{Aspergillus nigei)。原核细胞也可用于利用细菌细胞的生产系统。已知的细菌细胞包括大肠杆菌{E.coll)和枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)。可通过采用转化将目标抗体基因转移到这些细胞中，然后体外培养转化细胞，来获得抗体。
[0081]本发明的抗体的同种型不受限制。同种型包括例如IgG (IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA (IgAl和IgA2)、IgD和IgE。本发明的抗体也可以是包含负责抗原结合的部分的抗体片段或其修饰片段。术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，并且一般是指包含抗原结合结构域或可变区的片段。所述抗体片段包括例如Fab、F(ab’)2、Fv、包含用合适的接头偶联在一起的重链Fv和轻链Fv的单链Fv (scFv)、双抗体(diabody/diabodies)、线性抗体和由抗体片段制备的多特异性抗体。之前，通过用蛋白酶消化天然抗体来产生抗体片段；目前，采用遗传工程技术，用于将其作为重组抗体表达的方法也是已知的(参见 Morimoto 等,Journal of B1chemical and B1physical Methods24:107-117 (1992) ;Brennan 等，Science 229:81 (1985) ；Co, M.S.等，J.1mmunol,1994, 152, 2968-2976 ；Better, M.和Horwitz, A.H., Methods in Enzymology, 1989,178, 476-496, Academic Press, Inc.；Plueckthun, A.和 Skerra, A., Methods inEnzymology, 1989, 178, 476-496，Academic Press, Inc.；Lamoyi, E., Methods inEnzymology, 1989，121，663-669 ；Bird, R.E.等，TIBTECH, 1991，9，132-137)。
[0082]“Fv”片段是最小的抗体片段，含有完全抗原识别位点和结合部位。该区是二聚体(VH_\二聚体)，其中重链和轻链各自的可变区通过非共价健牢固地连接。可变区各自的3个CDR彼此相互作用在VH-\二聚体表面形成抗原结合部位。换句话说，重链和轻链的总共6个CDR作为抗体的抗原结合部位一起起作用。然而，另已知仅可变区(或一半Fv，其只含有3个抗原特异性CDR)能够识别并结合抗原，虽然其亲和力比完整结合部位的亲和力低。因此，本发明优选的抗体片段是Fv片段，但不限于这些。所述抗体片段可以是包含是保守的且可以识别和结合抗原的重链或轻链CDR抗体片段的多肽。
[0083]Fab片段(亦称为F(ab))还含有轻链恒定区和重链恒定区(CH1)。例如，抗体的木瓜蛋白酶消化产生两类片段:抗原结合片段，称为Fab片段，含有重链和轻链的可变区，其用作单一抗原结合结构域；和剩余部分，其被称为“Fc”，因为容易结晶。Fab’片段不同于Fab片段，因为Fab’片段还具有来源于重链CH1区羧基端的几个残基，其含有来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸残基。然而，Fab’片段在结构上等同于Fab，因为两者是包含重链和轻链可变区的抗原结合片段，其用作单一抗原结合结构域。在本文中，包含用作单一抗原结合结构域且相当于通过木瓜蛋白酶消化获得的重链和轻链可变区的抗原结合片段，称为“Fab样抗体”，甚至当它与通过蛋白酶消化产生的抗体片段不相同时。Fab’-SH是含在其恒定区具有一个或多个具有游离硫醇基的半胱氨酸残基的Fab’。F(ab’)片段通过切割F(ab’) 2铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键而产生。其它化学交联的抗体片段也是本领域技术人员已知的。抗体的胃蛋白酶消化产生2个片段；一个是F(ab’)2片段，其包含2个抗原结合结构域，并可与抗原交叉反应，另一个是剩余片段(称为pFc’)。在本文中，相当于胃蛋白酶消化得到的抗体片段当包含2个抗原结合结构域，并且可与抗原交叉反应时，称为“？(&13’)2样抗体”。例如，还可通过遗传工程，产生所述抗体片段。例如，还可从上述抗体噬菌体文库中分离所述抗体片段。或者，可以从宿主(例如大肠杆菌)中直接回收F (ab’) 2-SH片段，然后通过化学交联使之形成F (ab’) 2片段(Carter等，B1/Technology10: 163-167 (1992))。在备选方法中，可以从重组宿主的培养物中直接分离F(ab’)2片段。
[0084]术语“双抗体(Db) ”是指通过基因融合构建的二价抗体片段(例如P.Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP 404，097、TO 93/11161) 0一般而言，双抗体是2个多肽链的二聚体。在多肽链的每一个中，相同链中的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过短接头(例如约5个残基的接头)连接，使得它们不能结合在一起。因为2个区之间的接头太短，所以相同多肽链的丨和VH不能形成单链V区片段，而是形成二聚体。因此，双抗体具有两个抗原结合结构域。当针对两种类型的抗原(a和b)的\和V H区通过约5个残基的接头组合形成V u-VHjP V Lb-VHa,然后共表达时，它们作为双特异性Db分泌。本发明的抗体可以是这类Db。
[0085]可通过连接抗体的重链V区和轻链V区，来制备单链抗体(亦称为“scFv”)(有关scFv 的综述参见Pluckthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” 第 113卷，编辑 Rosenburg 和 Moore, Springer Verlag, N.Y.,第 269-315 页(1994))。用于制备单链抗体的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号4，946，778,5, 260, 203,5, 091, 513和5，4