磷灰石原位恢复的制作方法
【专利说明】磷灰石原位恢复
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求于2014年6月23日提交的美国临时申请第62/015, 894号和2014年 11月19日提交的美国临时申请第62/082, 017号的优先权，两者的全部内容通过引用纳入 本文。
【背景技术】
[0003] 在其它磷灰石固体表面之中，将磷灰石固体支持面，包括羟基磷灰石、陶瓷磷灰 石、氟磷灰石和氟强化磷灰石（fluoride enhanced apatite)，用于各种目标分析物的纯 化。磷灰石最常用于生物分析物纯化，所述生物分析物包括蛋白质、碳水化合物、多核苷酸 和病毒颗粒。磷灰石具有作为纯化支持物的独特性质，因为其在单一支持物中提供亲和性、 阳离子和阴离子交换形式。磷灰石纯化通常可以两种方式进行：（i)流动通过纯化；和（ii) 结合和洗脱纯化。
[0004] 通常，对于流动通过纯化，操作人员（a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定条 件下向柱中加入样品，在所述条件中杂质与所述柱结合而目标分子流动通过并被收集；（c) 用清洁/剥离溶液（例如高摩尔浓度磷酸盐溶液）清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化 合物；以及（d)用强碱性氢氧化物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一 些情况下，用低摩尔浓度的清洗液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新 平衡。
[0005] 通常，对于结合和洗脱纯化，操作人员（a)在合适的缓冲液中平衡柱；(b)在一定 条件下向所述柱中加入样品，在所述条件中目标分子与所述柱结合；（c)洗脱所述目标分 子（例如用高摩尔浓度磷酸盐溶液和/或碱性卤化物溶液）；(d)用清洁溶液（例如高摩尔 浓度磷酸盐溶液）清洁或剥离所述柱以去除吸附的生物化合物；以及（e)用强碱性氢氧化 物溶液再生或消毒所述柱从而可以重新使用所述柱。在一些情况下，用低摩尔浓度的清洗 液替代所述强碱性氢氧化物溶液，以用于长期保存或重新平衡。
[0006] 这些常规的磷灰石纯化方法的缺点在于差的再现性和/或过早的磷灰石劣化。在 一些情况下，该劣化是由于在暴露于平衡、加载或色谱缓冲液的过程中磷灰石表面水合氢 离子（H30+)的累积。水合氢离子的累积可在暴露于pH等于或低于8.0的碱金属盐的过程 中发生。水合氢离子的累积也可在暴露于pH小于约6. 5的磷酸盐缓冲液的过程中发生。其 它缓冲组合物也可引起水合氢离子累积。随后，当暴露于后续缓冲液，例如洗脱缓冲液（例 如在结合和洗脱纯化过程中）或清洁/剥离缓冲液（例如流动通过纯化之后）时，这些水 合氢离子解吸。所述解吸导致树脂随时间劣化，导致树脂质量损失和/或树脂的颗粒强度 降低。
【发明内容】
[0007] 本发明人发现，在由样品纯化目标分子的色谱过程中或之后，可通过用缓冲的钙 溶液处理磷灰石固体表面，接着用磷酸盐缓冲的溶液处理，接着用碱性氢氧化物处理而明 显减少、消除或逆转磷灰石固体表面的劣化。所述缓冲的钙溶液、磷酸盐缓冲溶液和碱性氢 氧化物可接下来应用于结合和洗脱或流动通过纯化过程。
[0008] 在一个方面，本发明提供一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法，所述方 法包括：(a)用目标分析物接触磷灰石固体表面，从而将目标分析物与一种或多种污染物 分离；(b)收集所述目标分析物；以及（c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括：（i)用 缓冲的钙溶液（包含浓度至少约为5mM的钙离子和缓冲剂）接触所述磷灰石固体表面，其 中缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约1、1. 5或2,所述溶液的pH至少为约5、5. 1、 5. 2、5. 3、5. 4或5. 5 ; (ii)用pH至少为约6. 5的磷酸盐缓冲溶液与所述磷灰石固体表面接 触；以及（iii)用含有氢氧化物的溶液接触所述磷灰石固体表面。在一个实施方式中，所述 缓冲剂是两性离子缓冲剂。在一个实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。
[0009] 在一个实施方式中，本发明提供一种用磷灰石固体表面纯化目标分析物的方法， 所述方法包括：(a)用目标分析物接触磷灰石固体表面，从而从一种或多种污染物中分离 目标分析物；(b)收集所述目标分析物；以及（c)再生所述磷灰石固体表面，所述再生包括： (i)用缓冲钙溶液（包含浓度至少约为10mM的钙离子和两性离子缓冲剂）接触所述磷灰 石固体表面，其中两性离子缓冲剂浓度与钙离子浓度的比例至少为约2,所述溶液的pH至 少为约6. 5 ; (ii)用pH至少为约6. 5的磷酸盐缓冲溶液与所述磷灰石固体表面接触；以及 (iii)用含有氢氧化物的溶液接触所述磷灰石固体表面。
[0010] 在一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中所述方法（a)包括将所述目标 分析物与磷灰石固体表面结合，以及（b)包括从所述磷灰石固体表面洗脱所述目标分析 物。在另一个实施方式中，所述方法（a)包括将所述磷灰石固体表面与所述目标分析物接 触，从而将所述目标分析物流动通过所述磷灰石固体表面，以及（b)包括在流动通过物中 收集所述目标分析物。
[0011] 在一些情况中，所述两性离子缓冲剂是含磺酸的缓冲剂。在一些情况中，所述含磺 酸的缓冲剂是MES、PIPES、ACES、M0PS0、MOPS、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPS、TAPSO、P0PS0 或HEPPSO、EPPS、CAPS、CAPSO或CHES。在一些情况中，所述含磺酸的缓冲剂是MES。
[0012] 在一个实施方式中，所述f丐离子至少为约lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、10mM(例如 10.ImM、10. 2mM、10. 3mM、10. 4mM或 10. 5mM)，20mM、25mM或至少为约 50mM。在另一个实施方 式中，缓冲剂浓度（例如两性离子缓冲剂浓度）与钙离子浓度的比例至少为约2. 5、3或4。 在另一个实施方式中，所述缓冲的钙溶液包含氯化钙或硝酸钙。在另一个实施方式中，所述 磷酸盐缓冲溶液包含含有约〇. 1M或0. 2M至10M磷酸盐，或0. 1M或0. 2M至0. 5M磷酸盐， pH为约6. 5-8的溶液，。在一些情况中，所述磷酸盐缓冲溶液包含400mM磷酸盐，pH为7. 0。
[0013] 在一个实施方式中，所述氢氧化物包括碱性氢氧化物。在一些情况中，所述碱性氢 氧化物包括氢氧化钠或氢氧化钾。在一个实施方式中，所述再生逆转或消除了在蛋白质纯 化或柱清洁步骤中发生的所述柱的降解。在另一个实施方式中，所述再生将磷灰石固体表 面的强度增加了至少约1 %、5%、10%、15%、20%或更多。
[0014] 在一个实施方式中，所述再生在洗脱吸附的生物化合物的磷酸盐清洁/剥离步骤 之前进行或替代上述步骤进行。在一些情况中，所述再生步骤在洗脱目标分析物之后进行。
[0015] 在一个实施方式中，所述（ii)将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐，pH至少为约 6. 5的溶液接触的步骤还包括：将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度为10mM或低于约 10mM，pH至少为约6. 5或7的溶液接触；随后将所述磷灰石固体表面与含有磷酸盐浓度至 少为约100mM、200mM、400mM或500mM，pH至少为约6. 5或7的溶液接触。
[0016] 在一个实施方式中，所述再生包括（i)、清洗、（ii)和（iii)。
【附图说明】
[0017] 图1 :显示了进行实施例7,表X的磷灰石纯化表征的结果。
[0018] 图2 :显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7,表X的纯化表征的结 果。
[0019] 图3 :显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7,表X的纯化表征的结 果。
[0020] 图4 :显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7,表X的纯化表征的结 果。
[0021] 图5 :显示了所示原位再生溶液的应用之后，进行实施例7,表X的纯化表征的结 果。
[0022] 定义
[0023] "磷灰石"是指通式为Ca5(P04)3(X)的磷酸盐和钙的矿物，其中X为带负电荷的离 子。通常X是F、C1或0H。不过磷灰石的结构和化学性质允许有多种替代，包括替代结构 中Ca的各种金属阳离子（例如K、Na、Mn、Ni、Cu、Co、Zn、Sr、Ba、Pb、Cd、Sb、Y、U或各种稀 土元素中的一种或多种），以及替代结构中P〇43的阴离子复合物（例如AsO43、S042、C032、 Si044等）。
[0024] "羟基磷灰石"是指包含结构式为Ca1(] (P04) 6 (0H) 2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物 的混合式固体支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基 磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。 复合材料形式包含包埋在琼脂糖或其它珠的孔内的羟基磷灰石微晶。
[0025] "氟磷灰石"是指包含结构式为Ca1(](P04)6F2的不可溶的磷酸钙的加氟 (fluoridated)矿物的混合式支持物。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金 属亲和力。氟化磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和 复合材料形式。
[0026] "磷灰石固体表面"是指稠合的纳米晶体（陶瓷磷灰石）、微晶或化合的磷灰石的 微晶。磷灰石固体表面包括但不限于羟基磷灰石或氟磷灰石。陶瓷磷灰石包括但不限于陶 瓷羟基磷灰石（例如CHT?)或陶瓷氟磷灰石。陶瓷磷灰石是磷灰石矿物的一种形式，其中 纳米晶体团聚成颗粒并在高温下熔凝以形成适用于色谱应用的稳定的陶瓷微球。化合的 微晶包括但不限于HAUltragel?(珀尔公司（PallCorp.))。微晶包括但不限于Bio-Gel HTP、HT、DNA级HT(伯乐公司（Bio-Rad))和HypatiteC(克拉克森色谱公司(ClarksonChromatography))。
[0027] "样品"是指含有感兴趣的目标分子或颗粒的任何组合物。样品可以未纯化或部分 纯化。样品可包括生物来源的样品，包括但不限于：血液或血液组分（包括但不限于血清）、 尿液、唾液、排泄物以及组织。样品可来源于未纯化的、部分纯化的或纯化的细胞裂解物或 用过的细胞生长介质。
[0028] 使用后出现的树脂劣化可造成树脂颗粒失去其强度，并因而断裂成导致柱内阻塞 的较小颗粒。劣化也可以磷灰石的化学破损形式出现，造成质量损失，这可转而导致出现 柱体积损失、颗粒强度损失、颗粒断裂增加或其组合。在本发明的一些实施方式中，通过本 发明逆转这类作用。可通过实践本发明而实现的劣化的逆转可导致较低的树脂质量损失速 率、较低的颗粒强度减弱速率，或同时导致上述两者。在许多情况中，劣化的逆转可伴随树 脂质量增加、颗粒强度增加或两者均有。
[0029] 可通过例如称重干燥的磷灰石样品，例如清洗掉缓冲液组分和吸附的生物化合物 后的样品，来测定磷灰石固体表面的质量。可通过例如测量耐搅动力（例如搅拌）、耐超声 处理或耐压缩（例如单轴压缩力的应用）来测定磷灰石介质强度。可通过检查处理后的磷 灰石固体表面以测量细小物质的生成来测定对超声处理或搅动力的耐受性。可通过测量将 给定质量的磷灰石压缩到设定的恒定终端力所需的力并测定压缩距离来测量耐压缩性。可 相对于没有经受过磷灰石纯化（例如使用磷灰石的目标分子的纯化）或磷灰石再生过程的 样品来测定磷灰石劣化或降解。
[0030] "碱性氢氧化物"是指包含元素周期表第1族中任何阳离子元素（包括例如锂 (Li)、钠（Na)、钾（K)、铷（Rb)、铯（Cs)和钫（Fr))的碱金属氢氧化物。