胰岛素样生长因子结合蛋白2在促进脂肪组织再生中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞技术领域，尤其设及膜岛素样生长因子结合蛋白2在促进脂肪 组织再生中的应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪组织可分为白色和栋色脂肪组织，栋色脂肪组织分布有限，主要功能是产生 热量，白色脂肪组织广泛分布于全身皮下组织及腹腔内，除用于胆存能量外，尚具有广泛而 复杂的内分泌功能。脂肪组织可分泌众多激素和脂肪细胞因子如瘦素、IGFUIGFBP3和抵抗 素等，运些细胞因子形成复杂的信号通路网络，作用于脑、肝脏、骨骼肌等全身器官组织，调 节机体的脂肪形成及代谢平衡、免疫功能等。先天及后天脂肪组织缺失，如获得性部分脂肪 营养不良、外伤等，临床表现为脂肪组织的丧失，严重影响患者的美观和身屯、健康。目前治 疗方法有限主要包括歴复体、整形美容手术等方法，但运些传统治疗方法尚不能使丧失的 脂肪组织获得理想的再生。随着干细胞、组织工程技术的发展及应用为脂肪组织的生物性 再生提供了更为有效的手段。组织工程技术是利用可降解生物材料、各种类型的种子细胞 及细胞因子相互复合，移植后可在宿主体内重建具有正常结构及功能的组织器官。
[0003] 干细胞发展及应用为组织生物性再生提供了更为有效的手段。研究发现间充质干 细胞具有自我更新、多向分化等能力，可W分化为组织修复所需的各种组织如脂肪组织、骨 组织等，与生物材料复合应用具有良好的修复自身缺损和改建周围组织的功能。近年来越 来越多的研究报道表明，间充质干细胞除免疫原性低、具备再生和修复功能外，还有较强的 免疫抑制及调节作用，并已安全和成功地用于临床，或结合组织工程技术进行组织再生，或 直接应用间充质干细胞对自身免疫疾病进行细胞治疗，是脂肪组织再生理想的治疗手段和 良好的种子细胞。
[0004] 研究表明，骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)作为经典的用于组织再生的间充质干细胞，其应用最为广泛。然而研究发现成人 BMSCs细胞数量及分离效率随供者年龄的增大而下降，同时自体间充质干细胞采集须行骨 髓穿刺术，其细胞来源较有限。自体脂肪干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)来源广泛，然而需二次手术增加了患者的额外痛苦。厮带间充质干细胞 (Wharton's jelly of umbilical cord stem cells,WJCMSCs)是存在于新生儿厮带组织 中的一种多功能干细胞，具有与骨髓间充质干细胞一致的自我更新、克隆形成、多向分化和 免疫调节能力，具有来源广泛、取材方便、体外扩增能力强，不存在伦理学限制W及免疫原 性低等优点，正逐渐成为间充质干细胞研究领域的热点。目前已广泛应用于自身免疫病治 疗，其安全性使得在科学研究和临床应用的前景更为广阔。
[000引膜岛素样生长因子系统由膜岛素、受体及膜岛素样生长因子结合蛋白组成，膜岛 素样生长因子结合蛋白作为膜岛素样生长因子轴的重要组成，共有6条单链多肤，在组织和 细胞中广泛表达，参与机体诸多病生理过程。IGFBP2(膜岛素样生长因子结合蛋白2， Insulin-like growth factor binding protein 2)是膜岛素样生长因子系统的重要组 成，大量存在于外周循环和骨髓腔中，与IGF有较高的亲和力。在新生儿快速生长期和骨堆 积高峰期，IGFBP2表达水平升高。研究表明IGFBP2基因敲除的小鼠有明显的骨组织形成缺 陷，然而IGFBP2在间充质干细胞成脂方面的作用少有研究。
[0006] 膜岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)是由处于分化期的白色脂肪前体细胞分 泌，运提示IGFBP2可能与脂肪组织形成及分化密切相关。有研究显示，过表达IGFBP2的转基 因大鼠，其体脂肪百分比显著增多。LLeng等研究表明IGFBP2基因是影响鸡脂肪形状的主 要因素之一。但IGFBP2对间充质干细胞成脂肪分化的作用及机制不清楚。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供膜岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)在促进间充质干细胞 介导的脂肪组织再生中的应用。本发明还设及IGFBP2在制备促进间充质干细胞介导的脂肪 组织再生的药物中的应用，W及IGFBP2过表达的间充质干细胞在制备治疗脂肪组织再生的 药物中的应用。
[0008] 本发明实现目的的技术方案是：
[0009] -种膜岛素样生长因子结合蛋白2在促进脂肪组织再生中的应用。
[0010] 膜岛素样生长因子结合蛋白2在促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生中的应 用。
[0011] 膜岛素样生长因子结合蛋白2在制备促进间充质干细胞介导的脂肪组织再生的药 物中的应用。
[0012] 膜岛素样生长因子结合蛋白2在制备治疗脂肪组织再生的药物中的应用。
[0013] 本发明的优点和积极效果是：
[0014] 本发明通过研究发现膜岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)具有促进间充质干细 胞成脂分化的作用，进而利用IGFBP2增强间充质干细胞再生脂肪组织的能力，并可预计能 够应用于治疗修复先天及后天性脂肪组织缺损。
【附图说明】
[0015] 图1为建立IGFBP2过表达的稳定转染细胞。图IA为mRNA检测外源性IGFBP2的表达 水平结果，图IB为蛋白水平检测外源性IGFBP2的表达结果；
[0016] 图2为IGFBP5过表达促进厮带间充质干细胞体外成脂分化。图2A为油红0染色图， 图2A-1至图2A-4为检测0周和诱导3周后油红0染色，图2B为脂滴定量检测检测图，测定OD值 来检测其成脂分化能力，图2C为在0周、1周、2周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成 脂分化的指标:PPARg，图2D为在0周、1周、2周的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成脂 分化的指标:LPL。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实例对本发明做进一步详细说明，但是此说明不会构成对本发明的限制 法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实 施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书 所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对运些实施方案 中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[001引实施例1
[0019] (1巧细胞的获取、培养
[0020] 购买厮带间充质干细胞，将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在a-MEM培养基（含 15 %胎牛血清、2mmol/L谷氨酷胺、lOOU/ml青霉素和lOOiig/ml链霉素）中37°C、5 % C02培养， 每2~3天换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80%汇合状态 时，用0.25 %膜蛋白酶按1:2消化传代。
[0021 ] (2)构建质粒病毒。
[0022] 通过NCBI数据库查询IGFBP2的基因序列，设计IGFBP2基因全长的PCR引物，用PCR 的方法得到IGFBP2的全长并加表面标记Flag化g，将其连接到逆转录病毒的表达载体上， 测序鉴定，最终构建成Flag-IGFBP2的质粒。然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装 后保存在-80度冰箱。
[0023] (3)稳定转染细胞系的建立
[0024] 对照质粒及Flag-IGFBP2的病毒转染厮带干细胞，转染48小时后，用G418筛选10天 得到IGFBP2过表达的稳定转染厮带干细胞，在mRNA(图1A)和蛋白水平（图1B)检测Flag的表 达鉴定外源性IGFBP2的表达。结果表明IGFBP2过表达稳定转染细胞的建立。
[002引实施例2
[0026] Real-time RT-PCR:
[0027] 1.引物设计，Primer 3及oligo 6等生物软件。
[0028] 2. RT-PCR 引物序列：
[0029] IGFBP2-F：CGTTCAAGTGCAAGATGTCTCTGAACG
[0030] IGFBP2-R：GGATCAGCTTCCCGGTGTTG [003。3. RNA 提取
[0032] 1)培养皿细胞弃上清，PBS冲洗2遍，加700ul QIAZOL，吹打混匀，收于EP管，室溫解 育5min，加140ul氯仿，强力震荡混匀15s，室溫解育3min，4°C12000g离屯、15min，收上清于新 EP管；
[0033] 2)取700ul样本至RNeasyRNA提取柱，4°C