ar大鼠补充 人转铁蛋白后的血清清除时间，在指定的时间点取血液样本，酶联免疫吸附测定(ELISA) A60219和人类转铁蛋白在血液样本中的浓度。 发明详述
[0027] 在背景中引用或描述的贯穿整个规范的各种出版物，这些都作为整体引用。关于 文档、行为、材料、设备、物品的讨论或者本规范已包含的相关讨论的目的是为本发明提供 背景信息。这样的讨论不是对部分或全部来自此前已经披露的发明的承认。
[0028] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术人员通常理 解普的相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有如说明书中所阐述的含义。必须指出， 如本文和所附权利要求中使用，单数形式"一"，"一个"和"该"包括复数引用，除非上下文另 有明确说明。
[0029] 本领域的普通技术人员都熟悉抗体的基本结构。每个轻链和重链各含有一个可变 区负责结合靶抗原。可变区包含抗原结合分子的决定因素，从而决定抗体对其靶抗原的特 异性。轻链和重链的可变区包括三个互补决定区（⑶R)。
[0030] 如本文使用的"互补决定区"或"CDR"是指重链或轻链可变区中，有助于特异性识 另Ij并结合抗原的氨基酸序列。CDR区包括CDRl，CDR2和CDR3。根据本发明的实施方案中，至少 CDRl，CDR2和CDR3中一种序列有助于抗体或其片段特异性识别和结合转铁蛋白，特别是人 转铁蛋白。
[0031] 如本文所使用的"抗体片段"包括任何合适的抗原结合抗体片段。例如，抗体片段 可包含一个单链可变区。根据本发明的实施方案中，抗体是指单域抗体SdAb。
[0032]如本文所用，"单域抗体"或"sdAb"是指骆驼科动物和鲨鱼重链抗体(HCAb)中天然 缺乏轻链的抗原结合区域。骆驼科动物包括骆驼，美洲驼和羊驼。骆驼科动物的HCAb的抗原 结合位点是由被称为VhH的一个可变结构域形成。sdAbs通常具有相对小的分子量，以单体 形式存在。根据本发明，一个sdAb具有三个⑶R(⑶Rl，⑶R2和⑶R3)。
[0033]如本文中"抗体或片段针对转铁蛋白，""抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，"和 "转铁蛋白抗体"应全都具有相同的含义，并且是指一种抗体或其片段，其是能够特异性结 合到转铁蛋白。
[0034]如本文所用，"sdAb针对转铁蛋白"，"sdAb特异性结合转铁蛋白，"和"转铁蛋白 sdAb "应全都具有相同的含义，并且是指一个单域抗体，其能够特异性结合转铁蛋白。
[0035]如本文所用，"转铁蛋白"广义地是指结合铁的蛋白质。转铁蛋白，作为本发明中使 用，可以是从任何机体能产生的转铁蛋白，最好是哺乳动物转铁蛋白，如人或猴转铁蛋白， 最好是人转铁蛋白。
[0036]如本文所用，"特异性结合"或"抗"在与抗体或其片段与转铁蛋白结合使用时，指 抗体和其片段，如sdAb，和转铁蛋白之间的结合或相互作用。抗体或其片段，如sdAb，根据本 发明和转铁蛋白的结合解离常数(Kd)在10-6和10-9M之间或更小，如解离常数在纳摩尔至 皮摩尔范围内（10-9到10-12)。
[0037]任何本领域中已知可以用于测定特异性抗原-抗体结合的方法，包括，例如表面等 离子共振(SPR)，竞争性结合测定法，诸如放射免疫测定(RIA)，酶联免疫测定(EIA)，夹心竞 争测定和这些方法不同的变化形式，以及其他本文中提及的技术。用于确定结合亲和力或 解离常数方法是本领域技术人员所熟知。
[0038] 任何本领域中已知可以用于表征本发明中抗体或SdAb的方法，如聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)，圆二色谱(CD)，分子体积排阻色谱法(SEC)等；用于鉴定蛋白质的方法，如 测定分子状态，熔融温度，分子量，纯度等，都为本领域技术人员所熟知。
[0039] 如本文所使用的蛋白或多肽"半衰期"，是指体内或体外试验时测定其浓度降低至 50%的时间。蛋白或多肽分子浓度的降低可以通过降解，清除，或在测定中的多肽的螯合引 起。多肽的半衰期可以通过本领域中已知的任何方式测定，如通过药物动力学分析来确定。 例如，为了测量在生物体内的蛋白质或多肽的半衰期，给温血动物（即人或以其他合适的哺 乳动物，例如小鼠，兔，大鼠，猪，狗或灵长类动物)施用合适的剂量的多肽;从动物收集血液 样品或其他样品；确定样品中的蛋白或多肽的水平或浓度;和之前给药的初始水平多肽的 水平或浓度相比时，基于测量数据计算已经减少了50%。见，Kenneth,A et al. ,Chemical Half-life of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists and Peters et al., Pharmacokinetic analysis:A Practical Approach(1996).
[0040] 如本文所用，"增加的半衰期"或"较长的半衰期"是指用于描述与对照相比，蛋白 半衰期任何一个参数的增长，如tl/2a，tl/2_i3和曲线(AUC)下区域的面积，其中任何两个参 数，或所有这些参数。
[0041] 如本文所使用的，"融合标签"是连接到靶蛋白质或多肽以产生融合蛋白为了便于 后续处理的多肽序列，如用于表达，纯化，体外和体内分析，蛋白质鉴定，或诊断或治疗应用 等。融合标签可以表现出一种或多种性能。例如，融合标记可以选择性地结合纯化介质使得 融合蛋白可以很容易地进行纯化的。融合标签可以是，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖结 合蛋白，多组氨酸(His-标签），FLAG标签，抗生物素蛋白，生物素，链霉亲和素，几丁质结合 结构域，抗体Fc区，绿色荧光蛋白等。
[0042]本发明包括针对转铁蛋白的抗体，以及利用抗转铁蛋白的抗体或片段以增加靶蛋 白半衰期的方法。如体外或体内血清中通过将包含靶蛋白和转铁蛋白的抗体或其片段的融 合蛋白暴露给铁蛋白。在一个具体的实施方案中，本发明也涉及新的转铁蛋白SdAb和它们 的用途。
[0043]因此，总体来说，本发明提供了特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段，该抗体或片 段，其包含选自下组中一种或多种序列： (a) -种互补决定区（⑶R)l，其包括选自下列序列组的氨基酸序列GSGFGINGVKSEQ ID N0：1)；GSGFGVNGVI(SEQ ID N0：2)；GNVFTIAAMG(SEQ ID NO：3)；GNVFTIAAMA(SEQ ID NO： 4)；GNVFTIDAMG(SEQ ID NO：5)；GSVFSIDAMG(SEQ ID N0：6)；GNVFGIDAVG(SEQ ID N0：7)； GSIFSIKVMG(SEQ ID N0:8);和GSIFPLNDMG(SEQ ID N0:9); (b) -种互补决定区⑶R2其包括下列序列组的中选出的氨基酸序列LIKSDGYTNYRESVKG (SEQ ID N0：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQ ID NO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：12)； GMTNGGKTNYADSVKG(SEQ ID NO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：14)； ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDN0:15);DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDN0:16)jP TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDN0:17)jP (c) 一种互补决定区⑶R3具有下列序列组的中选出的氨基酸序列PGVP(SEQ ID NO: 18)；VTKffAARVGGSAEYE(SEQ ID NO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQ ID N0：20)；RSKLIARINNPYEY (SEQ ID NO:21);RPKQATLIRDDY(SEQ ID NO:22);DLGCSGAGSCPDY(SEQ ID NO:23);和 DNRVGGSY(SEQ ID NO:24)。
[0044]根据本发明的实施例i，一个分离的抗体，最好是sdAb，或者抗体片段，包含选自由 SEQ ID NOs: 1-9组成序列组的CDR1，由SEQ ID NOs: 10-17组成序列中的CDR2,和由SEQ ID N0s:18-2^9CDR3。
[0045]根据本发明的实施例，分离的抗体或片段特异性结合转铁蛋白，且亲和力(KD)在 10-6和10-9M之间或更小，最好具有的亲和力低于10-9M。在一个最优选的实施方案中，根据 本发明分离的抗体或片段和转铁蛋白具有亚纳摩尔级的亲和力，例如，在皮摩尔范围内，如 I -1 OpM，15pM，20pM，30pM，40pM，50pM，60pM，70pM，80pM，90pM，或者 I OOpM ·
[0046] 在一个具体的实施方案中，根据本发明的实施例进行分离的抗体或其片段包含 SEQ ID NOl的CDRl氨基酸序列，SEQ ID NO 10的CDR2氨基酸序列，和的SEQ ID N018的CDR3 氨基酸序;根据本发明又一具体实施方案中，分离的抗体或其片段包含SEQ ID N03的CDRl 氨基酸序列，SEQ ID N012的CDR2氨基酸序列，和SEQ ID N019的CDR3氨基酸序列。在其它具 体的实施方案中，根据本发明它们的分离的抗体或其片段包含SEQ ID NO 6的CDRl氨基酸 序列，SEQ ID NO 14的CDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO 21的CDR3氨基酸序列；或者SEQ ID N07的CDRl氨基酸序列，SEQ ID NO 15的CDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO 22的CDR3氨基酸序 列；或SEQ ID NO 9的CDRl氨基酸序列，SEQ ID N017的CDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO 24的 ⑶R3氨基酸序列。
[0047] 根据本发明实施方案，抗体或其片段，如特异性结合转铁蛋白sdAb中，可以包括选 自由SED ID N0s:26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,和62组成 的氨基酸序列。
[0048]根据本发明的优选实施例，特异性结合转铁蛋白抗体或其片段是一种SdAb。例如， 一个根据本发明特异性结合转铁蛋白的sdAb可以是骆驼科动物的VHH抗体。
[0049]在本发明的一个特别优选的实施方案中，一个特异性结合转铁蛋白的sdAb包括 A60219的氨基酸序列：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTN YRESVKGRFTISRDDAKNTVWLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:26);A60401的 氨基酸序列：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGR FTISRDNAQNTMYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKWAARVGGSAEYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0：28)； A69449的氨基酸序列：QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTN YADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO： 56);A69433的氨基酸序列：QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTS GSSTNYADSVKGRFTISRDIAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO: 58);或A69447的氨基酸序列：QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVA TITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKNTVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:62)。
[0050]本发明还包含一个实施例的抗体或其片段的互补DNA(cDNA)序列，还包含可随后 用于下游应用如表达，纯化等的载体和宿主细胞。表达载体和重组宿主细胞可