一种提高蛋白血清半衰期的组合物和方法
【专利说明】一种提高蛋白血清半衰期的组合物和方法 发明背景
[0002]候选药物的药代动力学是一个关键参数，经常在很大程度上决定是否候选药物将 被进一步发展成药物，或用于治疗性应用。针对蛋白质类或多肽类药物，包括抗体的药代动 力学研究已经表明，这样的治疗剂具有完全不同的血清半衰期。那些多肽类和蛋白质类药 物一般具有短的血清半衰期，尽管可能具有治疗潜力，但往往不适合进一步的药物开发。例 如，白蛋白和γ-免疫球蛋白（IgG)已知具有的长达20天[1]的血清半衰期。此外，其他的IgG 的Fc结构域可以被工程化以改变它们与新生儿Fc受体的结合相互作用，达到延长血清半衰 期的方法[2]。然而，许多其他天然人蛋白质，如胰岛素，抗体片段，例如抗原结合片段(Fab 的）或单链可变片段(scFv)，以及短肽通常具有更短的血清半衰期，从数分钟到大约只需1 小时。因此，一种高效，低廉和安全的延长蛋白质和多肽这些分子血清半衰期的方法对于这 类分子成为治疗性药物、诊断工具等是至关重要的。
[0003]目前已经有几种策略被开发用于延长蛋白质和其他肽分子较短的半衰期，以避免 治疗或诊断的蛋白质因半衰期短被从体内清除。这几个用于促进蛋白质和多肽分子的血清 半衰期延长的技术，包括化学修饰，如聚乙二醇（即PEG化）[3]，融合抗体Fc区[4]，或者是和 天然具有长血清半衰期的蛋白质进行融合，如白蛋白[5]。不幸的是，这些技术遭受易引起 并发症，复杂的制造和鉴定工艺，低表达水平，可能产生的不希望的分子功能等问题的困 扰。
[0004] 最近一种采用使用抗血清蛋白抗体片段延长蛋白质和其它肽分子的血清半衰期 的方法被开发出来。白蛋白，主要是由于它的高血清浓度和长血清半衰期，一直是最适合选 定用于此目的。抗人白蛋白单域抗体在和IFN-a2b两个分子在基因水平融合，表达为融合蛋 白后可延长血清半衰期。[6,7]。新生成的融合蛋白分子的血清半衰期是不仅长于IFN_a2B， 但即使长于白蛋白的融合蛋白和IFN_a2B。
[0005] 骆驼重链抗体(HCAbs)的重链可变结构域，也称为VHH或单域抗体（sdAb也被开发 用于这一目的。例如，针对人白蛋白一个sdAb被证明将抗TNFa的sdAb片段的血清半衰期，从 不到一小时延长至两天以上[8]。
[0006] 另一种具有长半衰期的血清蛋白是转铁蛋白。转铁蛋白是血浆糖蛋白，其传送铁 离子和具有约3克/升的血清浓度和7-8天的血清半衰期。因此，转铁蛋白是一种理想的融合 蛋白，用于延长药代动力学不令人满意的肽分子的血清半衰期。有研究表明，和转铁蛋白融 合显著延长胰高血糖素样肽1(GLP1)[9]和乙酰胆碱受体[10]的血清半衰期。
[0007] 然而，使用抗体和抗体片段，如抗转铁蛋白sdAbs，用于增加蛋白类分子的血清半 衰期还未见报道。新的用于增加蛋白质的血清半寿期和用于生产具有改进的血清半衰期的 蛋白质的方法，高效率，成本优越，高产率将有利于新的蛋白质为基础的药物或者诊断试剂 的开发。本发明实例将涉及这样的方法。 发明简述
[0008] 本发明涉及针对转铁蛋白抗体，并且特指针对转铁蛋白的单域抗体(sdAbs)。本发 明还涉及使用特异性结合转铁蛋白的抗体，在转铁蛋白存在下增加靶蛋白的半衰期的方 法;包含在转铁蛋白存在下增加半衰期的靶蛋白的新型融合蛋白；在特异性结合转铁蛋白 的抗体或者融合蛋白的组合物。
[0009] 在总的方面，本发明涉及一个分离的抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，该抗体 或片段，其包含一种或多种选自下组中选择： (a) -种互补决定区（CDR)l，其包括下列之一的氨基酸序列GSGFGINGVI(SEQ ID NO: I)；GSGFGVNGVI(SEQ ID NO：2)；GNVFTIAAMG(SEQ ID NO：3)；GNVFTIAAMA(SEQ ID N0：4)； GNVFTIDAMG(SEQ ID NO：5)；GSVFSIDAMG(SEQ ID N0：6)；GNVFGIDAVG(SEQ ID N0：7)； GSIFSIKVMG(SEQ ID N0:8);和GSIFPLNDMG(SEQ ID N0:9); (b) -种互补决定区（CDR)2,其包括下列之一的氨基酸序列LIKSDGYTNYRESVKG(SEQ ID NO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQ ID NO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：12)； GMTNGGKTNYADSVKG(SEQ ID NO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：14)； ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDN0:15);DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDN0:16)jP TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDN0:17)jP (c) 一种互补决定区（CDR)3,其包括下列之一的氨基酸序列PGVP(SEQ ID N0:18); VTKffAARVGGSAEYE(SEQ ID NO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQ ID NO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQ ID N0:21);RPKQATLIRDDY(SEQ ID N0:22);DLGCSGAGSCPDY(SEQ ID N0:23);和DNRVGGSY (SEQ ID N0:24)。
[0010] 抗体或其片段最好是单域抗体，更好地是抗体或抗体片段，其是含SdAb A60219的： QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISRDDAKNT VffLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：26)；A60401: QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNT MYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKffAARVGGSAEYEYffGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：28)；A69449： QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTNYADSVKGRFTISRDNAENT VYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：56)；A69433： QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTSGSSTNYADSVKGRFTISRDIAKN TVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:58);或A69447: QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVATITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKN TVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:62)的氨基酸序列。
[0011] 本发明还涉及到一个融合蛋白包含本发明实施例的抗体或其片段，一个靶蛋白， 和一个随意的linker，其中抗体或其片段可融合到目标蛋白质的羧基末端或氨基末端， linker也随意地分割抗体和革巴蛋白。
[0012] 本发明还涉及一种核酸分子，其包含本发明实施例抗体或其片段编码cDNA或合成 的DNA，或者本发明实施例的融合蛋白的核酸编码序列，相关表达载体和宿主细胞。
[0013] 在另一个方面，本发明涉及一种提高靶蛋白的半衰期的方法。根据本发明的实施 例，该方法包括： (1) 获得融合蛋白，其中所述融合蛋白包含抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，所述靶 蛋白，和任选的I inker，其中所述抗体或其片段融合于靶蛋白的羧基末端或氨基末端，并且 任选的I inker分离抗体和靶蛋白的羧基末端或氨基末端;和 (2) 使融合蛋白与转铁蛋白结合，从而相对于单独靶蛋白，增加靶蛋白的半衰期。
[0014] 根据一个本发明的实施方案中，融合蛋白通过一如下方法获得： (a) 获得编码融合蛋白基因的表达载体； (b) 将表达载体导入宿主细胞以得到重组细胞； (c) 培养重组细胞，以允许融合蛋白的表达;和 (d) 从重组细胞获得所述融合蛋白。
[0015] 本发明的另一个一般性方面涉及一种组合物，其包含融合蛋白的有效量，其中所 述融合蛋白包含抗体或其片段特异性结合转铁蛋白，靶蛋白，和任选的linker，其中所述抗 体或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和任选的连接体分离抗体和靶蛋白的羧 基末端或氨基末端。该组合物最好还包含转铁蛋白。
[0016] 本发明还涉及一种方法，包括根据本发明实施例的组合物和转铁蛋白结合，从而 增加融合蛋白中靶蛋白的半衰期在。
[0017] 本发明的另一个方面涉及一种用于提高靶蛋白半衰期的系统，，该系统包括： (1) 一个表达载体，包含编码特异性结合转铁蛋白抗体或其片段的第一个核苷酸序列， 和任选的编码linker的第二个核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列连接在一起， (2) 宿主细胞，以及 (3) 转铁蛋白
[0018] 其它方面，特征和本发明的优点将从下面的公开内容可以看出，包括本发明的详 细描述及其优选实施方案和所附的权利要求。 附图的简单说明
[0019] 前面的概述，以及本发明的以下详细描述，结合附图来阅读时将更好地理解。附图 中已经展示的实施例是目前首选用于说明本发明的，然而，应该被理解的是，本发明不限于 所展示在附图中的实施例：
[0020] 图1是人转铁蛋白免疫美洲驼后的免疫应答曲线。
[0021 ]图2是19个分离得到结合人转铁蛋白单域抗体(SdAbS)的氨基酸序列的比对;互补 性决定区（CDR)和构架区（FR)之间用的空间；序列根据Kabat的编码方式编号；示出的sdAb 序列包括A60219(SEQ ID N0:26)，A13152(SEQ ID N0:30)，A12722(SEQ ID N0:34)，A12680 (SEQ ID N0:36)，A12690(SEQ ID N0:38)，A13154(SEQ ID N0:40)，A13146(SEQ ID NO: 42),A13149(SEQ ID NO：44),Al2666(SEQ ID N0：46),A12659(SEQ ID N0：48),A13355(SEQ ID N0：50),A12692(SEQ ID NO：52),A60401(SEQ ID NO：28),A13376(SEQ ID N0：32), A69476(SEQ ID N0:54)，A69449(SEQ ID N0:56)，A69433(SEQ ID N0:58)，A69441(SEQ ID N0:60)4PA69447(SEQIDN0:62);
[0022] 图3是从大肠杆菌表达纯化单域抗体460219 460401469433 469447和469449聚 丙烯酰胺凝胶检查图像，这些抗体的氨基酸序列示于图2;
[0023]图4转铁蛋白sdAbs结合人转铁蛋白的表面等离子体共振(SPR)传感图；图4A示出 A60401的在2nM，InM，0.5nM，0.25nM，and 0.125nM条件下SPR传感图变化的情节的底部结 合；图 4B示出A60219在不同浓度2nM，InM，0 · 5nM，0 · 25nM，and 0 · 125nM下SPR传感图。
[0024] 图5是转铁蛋白sdAbs A60401和A60219尺寸排阻色谱法的色谱(SEC)数据；
[0025] 图6示出了转铁蛋白sdAbs在202纳米，208纳米和217纳米由圆二色性(CD)的测得 转热变性曲线图；图6A示出A60219的热变性曲线；图6B示出A60401的热变性曲线；图6C示出 了A69433的热变性曲线；图6D显示A69447的热变性曲线；图6E显示A60449的热变性曲线；和
[0026] 图7显示单独人转铁蛋白，sdAb A60219，sdAb-A60219融合蛋白在Wist