通过本领域 中已知的方法获得。
[0051]本发明实施例中抗体或其片段，可以通过公开的方法从重组宿主细胞产生。重组 产生的抗体或其片段和来自天然存在的抗体或其片段不同，例如存在氨基酸的翻译后修 饰。"氨基酸的翻译后修饰"指的是氨基酸翻译后的任何修饰，如对一个或多个氨基酸独立 地进行一种或多种官能团的改变(如乙酸盐，磷酸盐，各种脂质和碳水化合物），改变的氨基 酸的化学性质(瓜氨酸化），或进行结构的变化(形成二硫键）。
[0052]根据本发明的实施方案中，核酸分子包括cDNA或合成的DNA序列，其编码选自SEQ ID 吣5:26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60，和62的氨基酸序 列。在本发明的具体实施方案中，核酸分子包括cDNA或合成DNA序列，其包含选自SEQ ID N0S:25,27,29,31，33,35,37,39,41，43,45,47,49,51，53,55,57,59 和 61 的序列。然而，本领 域的技术人员可以认识到是列出的特定核苷酸序列并非唯一的，因为不同核苷酸序列可以 编码相同的氨基酸序列。
[0053]如本文所使用的，"cDNA或合成的DNA"指的是一个DNA分子，其是与天然存在的DNA 分子相比至少有一个核苷酸序列的不同，分子的物理或化学性质也不同。例如，"cDNA或合 成的DNA"，可以和天然的基因组DNA序列不同，不含有一个或多个存在的内含子。"cDNA或合 成的DNA"也可以在一个或多个物理或化学性质上和天然存在的DNA不同，如具有不同的DNA 修饰，即便都包括相同核苷酸序列。
[0054] 如本文所使用的，"DNA修饰"是指对DNA任何的修饰，如通过独立地附着到DNA的一 个或多个核苷酸的一个或多个生化官能基(如甲基，磷酸基等）。不同的宿主细胞可以具有 不同的DNA修饰系统，从而产生不同的DNA分子，即使该DNA分子具有相同的核苷酸序列。
[0055] -个"cDNA或合成的DNA"，可以通过任何方法在体内或体外制备，只要所得到的 "cDNA或合成的DNA"，和天然产生的DNA分子不同。例如，一个"cDNA"，可通过信使核糖核酸 (mRNA)为模板在逆转录酶和DNA聚合酶，或RNA依赖性DNA聚合酶下产生。"cDNA"也可通过逆 转录酶对所需mRNA模板进行反转录和通过DNA引物扩增的聚合酶链式反应(RT-PCR)获得。 "合成DNA"可以通过本领域很多已知的方法在体外获得。"合成的DNA"也可以在体内产生， 宿主细胞产生的"合成DNA"也和天然产生的DNA有一个或多个物理或化学性质不同，如DNA 甲基化。
[0056] 本发明实施例还涉及特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段重组表达和纯化的方， 其包括如何获得含抗体或其片段编码序列的表达载体，表达载体如何导入宿主细胞，重组 细胞抗体或其片段表达的条件，如何从重组细胞获得的抗体或其片段。所述特异性结合转 铁蛋白的抗体或其片段可通过将裂解物，上清液，或重组细胞周质提取物，在亲和柱上进行 分呙。
[0057] 在另一个实施例中，通过融合标签促进特异性结合转铁蛋白抗体或其片段从重组 细胞中的纯化，例如，通过将裂解物，上清液，或重组细胞周质提取物，与融合标记结合配偶 相偶联的亲和柱结合。作为说明性和非限制性的例子，融合标记可以是一个6XHIS标签，6 XHis标签的抗体或其片段可以通过重组细胞产生并偶联在镍柱上。
[0058] 根据本发明的实施例，特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段，特别是sdAbs，具有 高亲和力（如皮摩尔级），且在血清中补充转铁蛋白后有更长的半衰期。我们认为，所述抗体 和其片段，如sdAb，和转铁蛋白之间的结合相互作用有助于抗体或片段在血清中的半衰期 延长。因此，将此类抗体或其片段用于融合靶蛋白将可提高血清半衰期。
[0059] 因此，总的来说，本发明涉及提高靶蛋白的血清半衰期的方法。所述方法包括：（I) 获得的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，所述靶蛋白， 和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合至羧基末端或氨基末端的靶蛋白，和连接体 任选分离抗体和羧基末端或靶蛋白的氨基末端;和(2)相对于单独的靶蛋白，使融合蛋白暴 露给的转铁蛋白，从而增加靶蛋白的半衰期。
[0060] 根据本发明的实施方案，转铁蛋白可以任何形式存在于工序中，包括血清或体外 制成的缓冲液。最好的是，所述融合蛋白通过向包含转铁蛋白的血清中注射。
[0061] 根据本发明的实施例，当暴露于转铁蛋白，所述融合蛋白具有增加的半衰期，如通 过测量相比于独自靶蛋白的半衰期。融合蛋白可任选地包含一个连接体，融合靶蛋白和抗 体或其片段，并且还起到阻隔靶蛋白和抗体或其片段的作用。通过linker将两个蛋白质分 子融合是本领域技术人员已知及公认的。
[0062] 所述的抗体或其片段可通过本领域已知的任何方式融合到靶蛋白如如通过基因 改造或共价偶联。该抗体或其片段可以融合到靶蛋白的氨基末端或羧基末端。
[0063] 所述融合蛋白包含根据本发明的实施例的抗体或其片段。例如，该抗体或其片段 包括以下氨基酸序列，CDRl的序列包含SEQ ID勵：1，2,3,4,5,6,7,8，或9;0?2的序列包含 SEQ ID N0:10，11，12，13，14，15，16，或17;和CDR3的序列包含SEQIDN0 :18，19,20,21，22， 23,或24。所述融合蛋白的抗体或其片段最好是一种sdAb并且更好的是含有A60219( SEQ ID N0:26)，A60401(SEQ ID N0:28)，A69449(SEQ ID N0:56)，A69433(SEQ ID N0:58)，或 A69447(SEQIDN0:62)的氨基酸序列。
[0064]根据本发明的实施方案中，靶蛋白是一种多肽或蛋白，如治疗性多肽，用于诊断目 的的多肽，或用于结构-活性研究的多肽。靶蛋白也可以是抗体，多肽，或已被或将被开发， 或用于治疗或诊断目的的任何其它多肽，或进行结构和/或功能分析的蛋白。所述靶蛋白最 好地是在血清中不稳定的治疗性的蛋白或多肽，需要增加血清半衰期的才能用于治疗，诊 断等目的。
[0065] 根据本发明实施例的融合蛋白可被用于本开的本领域已知方法的各种用途。例 如，融合蛋白可用于测定所述靶蛋白的亲和力的结合伴侣，用于药物筛选或靶点验证。它也 可以在诊断方法中使用，尤其是当该方法需要将靶蛋白质注射至血清。它可以进一步用于 治疗目的，特别是如果靶蛋白已知在血清是不稳定的。
[0066] 本发明的另一个一般性方面涉及一种组合方法，其包含融合蛋白的有效量，其中 所述融合蛋白包含特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，靶蛋白，和任选的连接体，其中所述 抗体或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和连接体任选分离抗体和靶蛋白的羧 基末端或氨基末端该组合法最好还包含增加了融合蛋白半衰期的转铁蛋白。该组合法也可 以进一步用于包含药学上可接受的载体，其可以包括适用于医药或诊断目的任何载体。
[0067] 根据不同的用途，有效量是可有效地提供一种治疗或诊断用途的靶蛋白时融合蛋 白的量。用于治疗应用时，有效量是，可治疗或预防疾病，失调等融合蛋白中靶蛋白的量；用 于诊断应用序时，有效量是指可检测出标记物的靶蛋白的量
[0068] 本发明实施例的组合物可用于体内或体外的任何目的。用于体内用途的组合物可 以配制成用于递送给受试者各种方法，例如哺乳动物，如人，大鼠，小鼠，猴，或兔，不限于口 月艮，局部，和注射的任何方法。用于体内使用的组合物最好是注射或静脉内给药。
[0069] 本发明还涉及一种方法，包括将本发明实施例的组合物暴露给转铁蛋白，从而增 加融合蛋白中靶蛋白的半衰期。
[0070] 在一个实施方案中，本发明与，根据本发明实施例中组合物以融合蛋白形式暴露 给转铁蛋白的方法相关，如实施到含有转铁蛋白的血清，或体外用于识别诊断或治疗试剂。
[0071] 在另一个实施方案中，一个根据本发明的方法包括向需要目标蛋白治疗的的受试 者实施根据本发明实施例的组合物，其中组合物包含特异性结合人转铁蛋白抗体或其片段 和靶蛋白的融合蛋白的治疗有效量。
[0072] 在又一个实施方案中，根据本发明的方法包括，将组合物给予需要由目标蛋白诊 断的受试者，其中该组合物包括融合蛋白的诊断有效量。
[0073] 本发明的实施例还涉及组合物，其包括根据本发明的融合蛋白和用其提高靶蛋白 半衰期的方法。组合物中用于提高靶蛋的半衰期的方法包括获得融合蛋白，分离融合蛋白， 包含针对转铁蛋白的抗体或其片段，所述靶蛋白和任选的连接体，其中所述抗体或其片段 的方法融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和任选的连接体分隔抗体或其片段和靶蛋白 的羧基末端或氨基末端，组合物中让融合蛋白暴露给转铁蛋白，其中所述融合蛋白比单独 的靶蛋白在组合物中具有更长的半衰期。
[0074] 不希望受到理论的束缚，信在特定的其中融合蛋白中的抗体或片段，和组合物或 者血清中的转铁蛋白之间的特异性结合有助于提高靶蛋白的半衰期。
[0075] 本发明实施例的还提供了用于获得具有增加的血清半衰期靶蛋白，和用于表达和 纯化包含结合于转铁蛋白抗体或其片段和靶蛋白的融合蛋白的方法。
[0076] 根据本发明的实施例，用于获得具有增加的血清半衰期靶蛋白的方法，包括： (a) 获得包含编码特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，所述靶蛋白，和任选的连接体融 合蛋白的表达载体，其中所述抗体或其片段融合至靶蛋白羧基末端或氨基末端，任选的连 接体分隔开抗体和靶蛋白的羧基末端或氨基末端； (b) 将步骤(a)的表达载体导入细胞以得到重组细胞； (c) 重组细胞生长且允许融合蛋白表达的条件； (d) 从重组细胞获得所述融合蛋白。
[0077] 编码融合蛋白的表达载体和表达融合蛋白的重组细胞可以通过本公开内容的本 领域已知的方法构建。适于重组生产融合蛋白的任何宿主细胞都可以使用，如哺乳动物细 胞，植物细胞，酵母细胞，或细菌细胞。宿主细胞最好是细菌细胞，并且更好地为大肠杆菌。 任何考虑本发明的披露内容，从重组细胞获得融合蛋白的方法都可以使用，不限于柱层析， 如亲和层析。
[0078] 在一个实施方案中，融合蛋白可以从重组细胞获得，并利用该融合蛋白的一部分 和转铁蛋白之间的特异性相互作用进行纯化，如通过将转铁蛋白偶联至亲和力柱用于纯化 特异性结合转铁蛋白的抗体或其片段融合表达的蛋白。
[0079] 在另一个实施方案中，融合蛋白可进一步在氨基末端或羧基末端包括融合标记， 以促进从重组细胞中纯化融合蛋白。融合标签可被融合到转铁蛋白，或结合转铁蛋白的抗 体或其片段其。例如，所述融合蛋白的裂解物，周质提取物，或上清液能够得到并用与融合 标记适当结合伴侣相关联的亲和柱进行纯化。在一个特定的和非限制性实例中，融合蛋白 可包括His标签，重组细胞裂解物，细胞周质提取物，包含融合蛋白的上清液可以得到并施 加到镍柱，通过洗涤和适当的缓冲条件从柱上洗脱融合蛋白。
[0080] 本发明的另一个一般性方面涉及一种系统，用于提高靶蛋白的半衰期，包括： (1) 一个包含编码特异性结合转铁蛋白抗体或其片段第一核苷酸序列，和编码任选的 接头第二核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列可操作地连接的表达载体； (2) 宿主细胞;和 (3) 转铁蛋白
[0081] 表达载体可以被用于构建表达载体的融合蛋白包含特异性结合转铁蛋白抗体或 其片段，靶蛋白，和任选的连接体，其中所述抗体或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基 末端，和任选的连接体分隔抗体和靶蛋白得羧基末端或氨基末端。因此，在本发明的某些实 施方案中，表达载体包含编码抗体或片段的第一核苷酸序列，其特异性地结合一个转铁蛋 白，任选的第二核苷酸序列，其编码连接体，和一个第三核苷酸序列编码靶蛋白，其中所述 第一，第二和第三核苷酸序列可操作地连接，使得所述的抗体或其片段融合至靶蛋白的羧 基末端或氨基末端，和任选连接体分离抗体和靶蛋白羧基末端或氨基末端。
[0082] 宿主细胞可以为表达融合蛋白构建重组细胞，例如，通过转化的宿主细胞与融合 蛋白的表达载体，使用在考虑到本发明的本领域已知的任何方法，包括但不限于电穿孔和 氯