mp;8 460401是一个纯粹的单体，用31^?^(16175柱在14.28毫升 洗脱体积处表现为一个单一的峰，，对应于10.6kDa的测量分子量，非常接近其计算的MW 14,3470&<^60219也极有可能为纯单体，因为它有一个单一的洗脱峰在13.98毫升，相当于 11.2kDa分子量。然而，其从比A60401洗脱略快表示A60219的单体和寡聚形式之间动态传输 可能存在的，因为它分子量较小。
[0118] 对A60219和A60401的圆二色谱测定，以估计其二级结构和热稳定性。这两种蛋白 质的圆二色谱是典型的单域抗体(数据未示出）。热变性分析测定温度范围从30到90°C，以2 °C为间隔。在202纳米，208纳米，和217纳米对温度绘制CD值，计算出A60219(图6A)和A60401 (图6B)熔融温度(Tm)分别与69 · 8°C和58 · 7°C。
[0119] sdAb A60219的血清清除
[0120] A60219由于其高亲和力，纯单体状态，和高热稳定性，用于测试其血清半衰期。 A60219被单独注射到大鼠或注射大鼠人转铁蛋白后后立即注射。人转铁蛋白也被注入到大 鼠并测量其血清半衰期，模仿人转铁蛋白在血液中的环境。用ELISA用来测量A60219的在不 同时间点注射后采取的大鼠血液中的浓度。
[0121]人转铁蛋白在Wi star大鼠血液中的清除首次被研究。注射30毫克人转铁蛋白至大 鼠后，收集七天血样。观察转铁蛋白浓度的逐渐稳步下降，所计算出的tl/2i3计算为22小时。 这是比人转铁蛋白在人的血清中半衰期显著缩短。尽管如此，在大鼠输注人转铁蛋白提供 了一个模型，用于评估A60219在人体内的血清半衰期。值得注意的是，所述抗人转铁蛋白抗 体不结合大鼠转铁蛋白，这使得sdAb血清清除的分析交叉反应性更加简单。
[0122] 对sdAb A60219的血清半衰期的研究，如许多其他动物模型中的sdAbs，A60219从 大鼠血液中快速清除。在约8小时仅有微量可以在大鼠血液中检测到。
[0123] 大鼠补充有人转铁蛋白时，A60219半衰期显著延长。它的血液清除率与人转铁蛋 白非常相似的，计算得出的血清半衰期也是22小时。这表明，当注射入人体，A60219也会产 生类似人转铁蛋白的血清半衰期。
[0124] 从血清清除研究结果表明，将包含抗转铁蛋白抗体或其片段的多肽的在人转铁蛋 白存在的情况下，显著增加体内分子的半衰期。
[0125] 参考文献 I.SleepjD.,J.Cameron,and L.R.Evans,Albumin as a versatile platform for drug half-life extension.Biochim Biophys Acta. 2·Kontermann，R·E·，Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics.Curr Opin Biotechnol.22(6):p.868-76. 3. Lee,L.S.,et al.,Prolonged circulating lives of single-chain Fv proteins conjugated with polyethylene glycol:a comparison of conjugation chemistries and compounds.Bioconjug Chemj1999.10(6):p.973-81. 4. Tuettenberg,J.,et al.,Pharmacokinetics,pharmacodynamics,safety and tolerability of APGlOl，a CD95_Fc fusion protein,in healthy volunteers and two glioma patients.Int Immunopharmacol.13(1):p.93-100. 5. Nolte,M.ff.,et al.,Improved kinetics of rIX-FP,a recombinant fusion protein linking factor IX with albumin,in cynomolgus monkeys and hemophilia B dogs.J Thromb Haemost.10(8):p.1591-9. 6. Holt，L.J·，et al·，Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs.Protein Eng Des Sel,2008.21(5):p.283-8. 7. Walker,A. ,et al. ,Anti - serum albumin domain antibodies in the development of highly potent,efficacious and long-acting interferon.Protein Eng Des Sel.23(4):p.271-8. 8.StorkjR.,D.Muller,and R.E-KontermannjA novel tri-functional antibody fusion protein with improved pharmacokinetic properties generated by fusing a bispecific single-chain diabody with an albumin-binding domain from streptococcal protein G.Protein Eng Des Sel,2007.20(11):p.569-76. 9. Matsubara,M.,et al.,Single dose GLP-I-Tf ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury.J Surg Res.165(1):p.38-45. 10. Keefe,D.,et al. ,In vitro characterization of an acetylcholine receptor-transferrin fusion protein for the treatment of myasthenia gravis.Autoimmunity.43(8):p.628-39. 11. Arbabi Ghahroudi，M.，et al.,Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.FEBS Lett, 1997.414(3):p.521-6. 12. TanhajJ.,A.Muruganandam,and D.StanimirovicjPhage display technology for identifying specific antigens on brain endothelial cells.Methods Mol Medj 2003.89:p.435-49. 13. Zhang,J.,et al.,A pentavalent single-domain antibody approach to tumor antigen discovery and the development of novel proteomics reagents.J Mol Biol，2004.341(l):p.161-9. 14. Cortez-Retamozo,V.,et al.,Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate.Cancer Res,2004.64(8):p.2853-7. 15. Luo,F.R.,et al·，Correlation of pharmacokinetics with the antitumor activity of Cetuximab in nude mice bearing the GEO human colon carcinoma xenograft.Cancer Chemother Pharmacol,2005.56(5):p.455-64.
【主权项】
1. 一种分离的特异性结合转铁蛋白抗体或其片段，其包含一种或多种选自下组中序 列： (a) -种互补决定区1(CDR1)，其氨基酸序列来自下列序列组成之一 GSGFGINGVI(SEQ ID N0：1)；GSGFGVNGVI(SEQ ID NO：2)；GNVFTIAAMG(SEQ ID NO：3)；GNVFTIAAMA(SEQID NO： 4)；GNVFTIDAMG(SEQ ID NO：5)；GSVFSIDAMG(SEQ ID N0：6)；GNVFGIDAVG(SEQ ID N0：7)； GSIFSIKVMG(SEQ ID N0:8);和GSIFPLNDMG(SEQ ID N0:9); (b) 互补决定区2,其氨基酸序列来自下列序列组成之一，LIKSDGYTNYRESVKG(SEQID NO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQ ID NO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：12)； GMTNGGKTNYADSVKG(SEQ ID NO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：14)； ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDN0:15);DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDN0:16)jP TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDN0:17)jP (c) 互补决定区3,其氨基酸序列来自下列序列组成之一，PGVP(SEQ ID N0:18); VTKWAARVGGSAEYE(SEQ ID NO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQ ID NO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQ ID N0:21);RPKQATLIRDDY(SEQ ID N0:22);DLGCSGAGSCPDY(SEQ ID N0:23);和DNRVGGSY (SEQID N0:24)。2. 根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，包括CDR 1，CDR的2和CDR 3。3. 根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO :18的氨基酸序列。4. 根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID N0:3，SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO :19的氨基酸序列。5. 根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO:6,SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO :21的氨基酸序列。6. 根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID N0:7，SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO :22的氨基酸序列。7. 根据权利要求1所述的分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID N0:9，SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO :24的氨基酸序列。8. 根据权利要求1所述的分离的抗体或片段，其包含以下选定序列号中的氨基酸序列： 26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,和62。9. 根据权利要求1~8任何一项要求分离的抗体或其片段为一个单域抗体(sdAb)。10. 根据权利要求9所述的sdAb，包含选自下列序列组中的氨基酸序列： A60219QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISR DDAKNTVWLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:26);A60401: QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNT M