化钙转化。
[0083] 该转铁蛋白可用于稳定融合蛋白，也可用于通过亲和层析来分离融合蛋白。
[0084] 根据一个本发明的实施例，该系统还可以包括一种经由融合蛋白的抗体或片段和 与固体支持物相关联的转铁蛋白之间的特异性结合，或通过融合蛋白中的融合标签和与固 体支持物偶联的融合标记的结合配偶之间的结合捕获融合蛋白的固体支持物。
[0085] 该系统还包括一种或多种融合蛋白的表达和/或分离是有用的缓冲液。
[0086] 以下具体实施例进一步说明本发明的内容，但需要理解的是，本发明不限于以下 内容。 示例
[0087] 实施例1:特异性结合转铁蛋白sdAbs生产和表征 [0088]材料与方法
[0089] 从美洲驼免疫噬菌体抗体库分离转铁蛋白sdAbs
[0090] 一种雄性美洲驼(大羊驼)在1，22，36，50和64天，皮下分别注射100微克，50微克， 50微克，10微克，并10微克人转铁蛋白[11]。完全弗氏佐剂（Sigma公司，圣路易斯，密苏里 州）用于初次免疫，不完全弗氏佐剂被用于随后的第2-4免疫接种，最后一次免疫不用佐剂。 美洲驼在每次免疫后取外周血并收集的外周血白细胞，然后将其贮存在80°C直至进一步使 用。
[0091] 使用QIAamp RNA血液迷你试剂盒（Qiagen公司）从IX 108白细胞分离总RNA。以 566ng总RNA作为模板，使用随机0)6作为引物合成(^麻。四个正向引物？441_￥!1冊1 (GCCCAGCCGGCCATGGCCSMBGTRCAGCTGGTGGAKTCTGGGGGA；SEQ ID NO：63),P442_VHHF2 (GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGA；SEQ ID NO：64),P759_VHHF3 (GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCT; SEQ ID N0:65WPP444_VHHF4 (GCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGG;SEQ ID N0:66);和两个反向引物P445_ CH2R(CGCCATCAAGGTACCAGTTGA；SEQ ID N0:67)和P446_CH2b3R (GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGA SEQ ID N0:68)用于扩增常规免疫球蛋白G抗体（IgG) Vh-ChI-Hinge - Ch2或重链抗体的VhH-Hinge - Ch2区。约600bp的以P445_CH2R与四个正向引物 P441_VHHF1，P442_VHHF2，P759_VHHF3，和 P444_VHHF4的引物组合扩增的 VHH产品从 1 % 琼脂 糖凝胶中提取并用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，引物P446_CH2R PCR产物也进 行纯化。在第二轮PCR反应中，两个引物，P440_VHHF (CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC；SEQ ID NO:69)和P447_VHHR (CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTG; SEQ ID NO: 70)被用来引入Sfi I限 制性酶切位点，并且扩增从组合扩增产物的最终sdAb片段。最终的PCR产物用SfiI酶切并连 接入在金斯瑞公司构建的噬菌粒载体，并通过电转化到大肠杆菌TGl中。通过辅助噬菌体 Ml 3K07 (NEB)对文库进行噬菌体拯救和扩增。
[0092]美洲驼免疫噬菌体展示文库通过转铁蛋白偶联M-280磁珠（Invitrogen)进行液相 淘选。约3X HTll的噬菌体加入到磁珠中在37°C孵育2小时进行抗原结合。除去处置未结合 的噬菌体之后，将磁珠用含有0.05%吐温20磷酸盐缓冲盐缓冲液(PBST)洗涤六次，并且每 轮增加一次洗涤。特异性结合的噬菌体被1〇〇μ1的IOOmM三乙胺和洗脱液温育10分钟后洗 脱，随后用200μ1的IM的Tr is -HCl (ρΗ7.5)中和。如上所述，经过两轮淘洗，洗脱的噬菌体用 于感染指数生长期的大肠杆菌TG1。单菌落的噬菌体将通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行 检测。
[0093]对于噬菌体ELISA，96孔微量滴定板中被以2微克/毫升的人转铁蛋白包被过夜，然 后用4%改性的磷酸盐缓冲盐水(MPBS)进行封闭，37°C下2小时。从单个克隆的噬菌体分别 用4%MPBS预封闭过夜，加入到预封闭的微孔板中，并温育1小时。噬菌体ELISA采用通用电 气医疗检测模块的重组噬菌体抗体系统(GE Healthcare公司，乌普萨拉，瑞典），阳性噬菌 体将被克隆测序。
[0094] sdAbs 的表达
[0095] 编码各 sdAb(A60401，A60219，A69433，A69447,或 A69449)(图 2)的 DNA 通过 BbsI and BamHI位点被克隆到一个sdAbs C端会被添加了5X组氨酸纯化标记的分泌质表达载体 pSJF2H[12]中。这些sdAbs在周质腔表达并通过固定化金属离子亲和层析aMAC)[13]纯化。 简言之，将阳性克隆接种在25ml LB-氨苄青霉素中，在37°C温育用200rpm振摇过夜。第二 天，将20ml培养物被用于接种1升M9培养基中（0.2 %葡萄糖，0.6 %磷酸氢二钠，0.3 %磷酸 二氢钾，0.1 %氯化铵，0.05 %氯化钠，ImM的氯化镁，0.1 mM的氯化钙），补充0.4%酪蛋白氨 基酸，5晕克/升的维生素 Bl，和200微克/毫升的氨节青霉素，并培养24小时。之后加入100晕 升10 X TB培养基（12 %蛋白胨，24 %酵母提取物和4 %甘油），2毫升100mg/ml的氨苄青霉素， 1毫升IM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)，再继续孵育培养65-70小时，在28°C，200rpm振 荡。大肠杆菌细胞通过离心收集并用溶菌酶裂解。细胞裂解物离心，澄清的上清液装到 High-Trap?螯合亲和柱(GE Healthcare)上，用His标签的蛋白质进行纯化。
[0096]表面等离子体共振(SPR)分析
[0097] 使用BIAcore T200光学传感器平台和研究级CM5传感器芯片(GE Healthcare)进 行实验。人转铁蛋白通过标准胺偶联固定在传感器芯片表面。所有实验均在HEPES缓冲液 [IOmM的HEPES(pH 7 · 4)中，150mM氯化钠，3 · 4毫摩尔EDTA，0 · 005% 吐温20]中和25°C下进 行。除非另有说明，抗体在浓度从〇. 25nM至16nM系列稀释，以30微升/分钟的流速注射。从结 合的分析物的量减法空白对照表面被显示为相对响应单位(RU)。每次注射系列设双参考传 感并使用BIA评估软件(GE Healthcare)对结合动力学进行分析。
[0098] 尺寸排阻色谱
[0099] 尺寸排阻色谱法（SEC)sdAbsA60401 和 A60219 用 Superdex 200? 柱（GE Heal thcare )，进行了分析（图5)。Superdex分离在PBS中进行。低分子量标记物核糖核酸酶A (13.7kDa)，胰凝乳蛋白酶A(25kDa)和卵清蛋白（43kDa)被用来计算sdAbs的Mff。
[0100] 圆二色谱法测量sdAbs熔融温度
[0101] 蛋白质用Superdex75 SEC柱分离至IOmM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。收集蛋白质的主 要成分峰用于圆二色性(CD)分析使用。使用J - 815的CD光谱仪(JASCO )，蛋白浓度100微克/ 毫升，10毫米的石英比色皿中，收集在250至200纳米处的⑶光谱。CD光谱测定以2°C的间隔 从30°C扫描至90°C，以1°C/分钟的温度变化速度测定蛋白质的热变性。在202纳米，208纳米 和217纳米处以椭圆率对温度作图，在三个波长下平均的Tm计算熔融温度(TMS)。
[0102] 血清半衰期测定
[0103] 一组三只雌性Wistar大鼠，每个重约250个克，在尾静脉注射30mg人转铁蛋白后， 立即分别为静脉注射30毫克人转铁蛋白，和500微克sdAb A60219，A60401，A69433，A69447， 或A69449。通过在指定的时间点的从眼睛玻璃毛细管收集血液。分离血清并储存在-80°C直 至进一步使用。上述收集样品中被注射的抗体分子的浓度将用ELISA测定。
[0104] 对于转铁蛋白浓度测定，将抗转铁蛋白抗体[HTF-14] (Abeam公司，ab769)在微量 滴定板(Costar，9018)中，以lμg/ml的浓度在4°C下过夜。用I3BST洗涤三次后，以含I %BSA的 PBST在37°C封闭平板两小时。。血清被稀释(在0.05%roS-T中1%BSA用作稀释剂)后加入到 微孔板中，在37°C下2小时。用PBST洗涤四次，HRP标记的抗转铁蛋白抗体(0.1微克/毫升） (Abeam公司，ab9538)加入到孔中并温育1小时。该板用I 3BST洗涤后，加入TMB底物10分钟进 行显色，通过加入IM盐酸停止反应。各孔使用分光计450纳米进行吸光度测定。以人转铁蛋 白在1%BSA的PBST的系列稀梯度用于产生人转铁蛋白浓度分析的标准曲线。
[0105]同样的方法也用于sdAbs的检测中，除抗sdAb的兔多克隆抗体(金斯瑞）用作捕获 抗体和HRP标记的抗SdAb兔多克隆抗体(0.1微克/毫升）（金斯瑞)为作为检测抗体。以1 % BSA PBST的对sdAbs系列稀释，用于制作标准曲线的sdAbs的浓度。
[0106] 结果
[0107] 分离和鉴定sdAbs
[0108]通过使用人转铁蛋白免疫美洲驼，建立免疫噬菌体展示文库，淘选来实现特异性 sdAbs的分离。
[0109] 人转铁蛋白在美洲驼中引起了一定的免疫反应，约25000倍稀释的第五次免疫后 血清仍然检测到阳性(图1)。
[0110] 大约IX Γ08美洲驼白细胞被用于mRNA分离，然后将其用于噬菌体文库的构建。所 得到的文库的大小为2ΧΠΓ8,正确插入率为92%。经过两轮固定人转铁蛋白的液相淘选， 特异性噬菌体被富集(数据未显示）。噬菌体ELISA表明，所分析的克隆约88%结合到转铁蛋 白。在噬菌体克隆显示的sdAbs的编码序列的分析结果显示19个不同的sdAb氨基酸序列 (SEQ_ID 号：26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60 和 62,和图 2)。
[0111] A60219，A60401，A69433，A69447 和 A69449这5 个 sdAbs 分别被亚克隆到 C-末端标记 有一个6 X组氨酸(His)标签的大肠杆菌周质表达载体pSJF2H[ 12]中。然后在大肠杆菌中表 达，并通过 IMAC(图 3)进行纯化。460219,460401469433 469447和469449的8(^13每升了61培 养产率分别为8.4,8.5,12.5,17.2和7.8毫克。
[0112] 基于SPR生物传感器结合分析，这五个转铁蛋白sdAbs，A60219，A60401，A69433， A69447和A69449,可以结合人转铁蛋白（图4)，其中，A69433，A69447和A69449,显示出与人 类和猴子的转铁蛋白（表2)有的交叉结合活性。
[0113] 结果详细呈现于表1和表2和图4中。例如，sdAbs A60401和A60219的结合率分别为 9.27 X 10~5和5.14 X 10~7的M-IS-I，和解离速率6.22 XHT-5和6.74 XHT-4S-1 ddAbs的 解离常数(KDS)计算为 Α6040167·14ρΜ为（图 4A)和 Α6021913·1ρΜ(图 4B)。
[0114] 表1 SPR测定转铁蛋白sdAbs(A60219和Α60401)结合人转铁蛋白
[0116] sdAbs 的鉴定
[0117] 尺寸排阻色谱法（SEC)来评估两个sdAbs A60401和A60219是否作为单体存在（图 5)。如同大多数骆驼科动物8(^&a