为模板，按Roche 公司Faststart Universal SYBR Green Master(Rox)说明书配制qPCR的体系并设置反应程序：
[0071] 取新PCR管依次加入FastStart Universal SYBR Green Master(R0X)10iiL、10iiM 上下游引物各〇.6yL和cDNA模板1.5yL，用PCR-grade水补足至20yL。混匀后甩至管底，使用 ABI 7300荧光定量PCR仪进行qPCR检测。反应条件:95°C预变性10min;95°C15s，60°C60s，* 40个循环。同时以B5S基因为内参基因，应用ABI 7300SyStem分析获得PCR扩增的实验数据， 采用2_AAet相对定量法计算比较表达量位数差异。
[0072] 茎环法qRT-PCR检测小RNA表达量的结果如图1-3所示。家蚕细胞在感染病毒早期 (24h内），bm〇-miR-3378表达量出现显著降低；而转染bmo-miR-3378类似物或抑制物后， bmo-miR-3378表达量分别出现显著增高或显著降低。这表明bmo-miR-3378在BmNPV感染家 蚕细胞过程中具有一定作用。同时，本发明构建的BmN细胞bmo-miR-3378过表达/抑制表达 处理与检测体系是有效的。
[0073] 实施例2 bmo-miR-3378对家蚕BmN细胞诱导凋亡影响的Caspase活性检测 [0074] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以 M0I = 0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。
[0075] (1)在接毒培养12h、24h、48h和72h后分别收集细胞，4°C1000rpm离心10min;
[0076] (2)用冰冷PBS缓冲液洗涤细胞沉淀，4°C lOOOrpm离心10min;
[0077] (3)弃去PBS缓冲液，加入Promega公司CaspACE Assay System(Colrimetric)试剂 盒中的细胞裂解液重悬细胞；
[0078] (4)置于-80°C下约2min使细胞液完全冰冻，随后冰上解冻约20min;
[0079] (5)待细胞液完全解冻后，冰上静置15min;
[0080] (6)重复冻融1次以确保细胞被完全裂解，4°C13000rpm离心20min，取上清用于凋 亡检测或储存于-80°C备用。
[0081] 按照CaspACE Assay System(Colrimetric)试剂盒说明书处理样品后，在多功能 酶标仪上检测各样品在405nm处的吸光度值。
[0082] 检测结果如图4-5所示。经bmo-miR-3378类似物转染处理后，家蚕细胞的凋亡水平 在病毒感染早期（24h内）呈极显著增高（p〈0.01)，后随时间延长而差异不再显著；经bmO-miR-3378抑制物转染处理后，家蚕细胞的凋亡水平在病毒感染后48h内均呈显著降低（p〈 0.05)。这表明bmo-miR-3378表达量变化可显著影响家蚕细胞对病毒的凋亡反应。
[0083] 实施例3 bmo-miR-3378对家蚕BmN细胞活力影响的MTT活性检测
[0084] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以 M0I = 0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。
[0085] 在接毒培养12h、24h、48h和72h后弃去原培养液，加入500yL新鲜无血清的Sf-900II SFM(1 X )细胞培养液，再每孔加入25yL MTT，混匀后于27°C培养4h;吸去培养液后加 入750yL DMS0;摇床震荡10min，采用多功能酶标仪在490nm波长处检测每孔的光密度。 [0086] 检测结果如图6-7所示。经bmo-miR-3378类似物转染处理后，家蚕细胞活力在病毒 感染24h后呈显著增高；而经bmo-miR-3378抑制物转染处理后，家蚕细胞活力在病毒感染 24h后却呈显著降低。这表明bmo-miR-3378表达量变化可显著影响家蚕细胞感染病毒后的 活力。
[0087] 实施例4 bmo-miR-3378对BmNPV增殖力影响的qRT-PCR检测
[0088] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以 M0I = 0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。
[0089] 在接毒培养12h、24h、48h和72h后分别收集细胞病毒悬液，取200此按Roche公司 High Pure Viral Nucleic Acid Kit说明书少量纯化病毒基因组DNA。
[0090]设计并合成用于病毒qPCR的上游引物(序列如SEQ ID NO.7所示）和下游引物(序 列如SEQ ID .8所示），以病毒基因组0難为模板，按上述的1?〇(3116公司？38七8七31^ Universal SYBR Green Master(Rox)说明书配制qPCR体系并设置反应程序，进行病毒定量 PCR检测。
[0091]测定纯化获得的病毒DNA样品浓度，根据下列公式计算每微升DNA样品中含有的 BmNPV-DsRED拷贝数（Copies/yL):DNA浓度（ng/yL) X 6.02 X 1023X 10-9/(6 6 0 Xbases)。其 中，每个碱基分子量按660Da计算，阿伏伽德罗常数为6.02 X 1023，bases为DNA碱基数。以此 计算获得病毒DNA标准品的拷贝数为1.49\1011〇叩1^/此。将病毒0嫩标准品用(1(11120按10 倍梯度稀释后，分别取1此作为模板进行qPCR反应，制作标准曲线，进而对各样品的病毒DNA 进行定量分析。
[0092] 检测结果如图8-9所示。BmNPV感染经bmo-miR-3378类似物转染处理的家蚕细胞， 病毒的DNA拷贝数在感染后72h内呈极显著降低;而感染经bmo-miR-3378抑制物转染处理的 家蚕细胞，病毒的DNA拷贝数在感染后72h内却呈极显著增高。这表明bmo-miR-3378表达量 变化可显著影响BmNPV在家蚕细胞中的增殖。
[0093] 实施例5 bmo-miR-3378对BmNPV感染力影响的Reed-Muench终点稀释检测 [0094] 按上述方法对BmN细胞转染bmo-miR-3378类似物或抑制物及其各自对照48h后，以 M0I = 0.15量接入BmNPV-DsRED重组病毒。在接毒培养12h、24h、48h和72h后分别收集细胞病 毒悬液，用0.22wii滤膜过滤除去病毒液中的细胞碎片后，用细胞培养液按10 X作10次连续 梯度稀释。
[0095] 在96孔板中全部接入100yl BmN细胞(约6X104个/孔），27°C下用含10%胎牛血清 的Sf-900II SFM培养液培养3h。然后，将病毒稀释液按列（即8孔)分别接入细胞中，每孔接 毒l〇〇yl;剩余2列细胞中加培养液lOOiil，设为对照。置于27°C下培养，每天在荧光显微镜下 观察并记录每列出现红色焚光的孔数，并按照Reed-Muench法(Reed和Muench，1938)计算病 毒的TCIDso和M0I值。
[0096] 检测结果如图10-11所示。BmNPV感染经bmo-miR-3378类似物转染处理的家蚕细胞 后，病毒的滴度水平呈极显著降低;而感染经bmo-miR-3378抑制物转染处理的家蚕细胞后， 病毒的滴度水平却呈极显著增高。这表明bmo-miR-3378表达量变化可显著影响BmNPV对家 蚕细胞的侵染力。
【主权项】
1. bmo-miR-3378在促进家蚕细胞凋亡中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 3. bmo-miR-3378在制备抗家蚕杆状病毒感染的药物中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述杆状病毒为核型多角体病毒。 5. bmo-miR-3378类似物在促进家蚕细胞凋亡中的应用，其特征在于，所述bmo-miR-3378 类似物为双链 RNA 序列，核苷酸序列如 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID NO. 10 所示。 6. bmo-miR-3378类似物在制备家蚕杆状病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述 bmo-miR-3378类似物为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示。 7. bmo-miR-3378抑制物在抑制家蚕细胞凋亡中的应用，其特征在于，所述bmo-miR-3378 抑制物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 13 所示。 8. bmo-miR-3378抑制物在家蚕生物反应器中促进重组杆状病毒增殖与侵染的应用，其 特征在于，所述bmo-miR-3378抑制物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示。9. 一种家蚕杆状病毒病的防治方法，其特征在于，采用bmo-miR-3378或其类似物转染 受杆状病毒感染的家蚕细胞;所述bmo-miR-3378的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述类 似物的为双链RNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示。
【专利摘要】本发明公开了一种与家蚕细胞凋亡相关的miRNA在抗病毒感染中的应用。本发明发现bmo-miR-3378在家蚕BmN细胞感染BmNPV的过程中表达量显著降低，说明其在病毒与寄主互作中的具有特定的功能；并通过实验证明bmo-miR-3378能够通过调控BmN细胞的凋亡，进而影响病毒的增殖与侵染，其可以作为调控杆状病毒感染的新的小RNA，对当前蚕业生产中的家蚕抗病毒防治与育种以及促进家蚕生物反应器产业化发展具有重要的现实意义。
【IPC分类】A61K31/7088, A61K31/713, A61K48/00, A61P31/20
【公开号】CN105561340
【申请号】CN201511007518
【发明人】蒋彩英
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月28日