验的肿瘤组织所产生的PpIX红色荧光观察结果。
【具体实施方式】
[0052]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0053]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0054]以下实施例中所用细胞株为人乳腺癌细胞株MDA-MB-435。
[0055] 所用培养基:DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0 ? 25 %胰酶-EDTA(Trypsin-EDTA)、磷 酸缓冲液(PBS)、青链霉素双抗溶液(Penici 11 in-Streptomycin)均购自Gibco公司。
[0056] 所用试剂：阳离子脂质体转染试剂盒(Transmessenger kit，Qiagen公司）、阴性对 照siRNA(negative control siRNA，Qiagen)、Trizol (Invitrogen公司）、Primescripi/ RT Master Mix kit(TaKaRa)、:SYBIi?:Premix EX TaqTM II kit(TaKaRa)、TaqMa.n?:基因表达 试剂盒（美国应用生物系统公司）、增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）、抗体Anti-FECH(Santa Cruz)、抗体 anti_GAPDH(Santa Cruz)、30% 甲叉双丙稀酰胺（30% Aerylamide/Bis Solution，Bio-rad)、TEMED(Bio-rad)、细胞裂解液(Bio-rad)、磷酸酶抑 制剂(Bio-rad)。
[0057]所用仪器：水套式C02培养箱（Forma II Water Jacketed C02Incubator， Thermo)、激光共聚焦显微镜、倒置显微镜、Spectra Max M2多功能酶标仪、ABI Prism 7000 型荧光定量PCR仪等均为市购。
[0058]另外，以下实施例中所用的统计学方法：采用spss 15.0统计软件进行统计学处 理，实验结果(均数土标准差)表示。应用组间t检验，p〈0.05有统计学意义，纵坐标每个值代 表三次独立实验平均值。
[0059] 实施例1FECH-siRNA的设计
[0060] 以NCBI网站上的序列NM_000140.2(核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)为根据，设计 了 3 个双链 siRNA 片段，分别为 740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA 和 3389FECH-siRNA，其核苷 酸序列分别如SEQ ID N0.2~7所示：
[0061] 1、双链740FECH-siRNA
[0062] (1)740FECH-S1 (如SEQ ID 从).2所示）：
[0063] 5，GCAGCUUAAAUGCCAUUUAUU 3，（正义链，第二条链）；
[0064] (2)740FECH-AS1 (如SEQ ID 从).3所示）：
[0065] 3'UUCGUCGAAUUUACGGUAAAU 5'（反义链，第一条链，与SEQ ID N0.1 所示序列的740 ~758位核苷酸互补）。
[0066] (SEQ ID NO. 1 所不序列的740~758位核苷酸：gcagcttaaatgccattta) 〇
[0067] 2、双链 1072FECH-siRNA
[0068] (1)1072FECH-S2(如SEQ ID N0.4所示）：
[0069] 5，GGUCCUCAAACAGACGAAUUU 3，（正义链，第二条链）；
[0070] (2)1072FECH-AS2(如SEQ ID N0.5所示）：
[0071] 3'UUCCAGGAGUUUGUCUGCUUA 5'（反义链，第一条链，与SEQ ID N0.1 所示序列的 1072~1090位核苷酸互补）。
[0072] (SEQ ID NO. 1 所不序列的 1072~1090位核苷酸：ggtcctcaaacagacgaat) 〇
[0073] 3、双链3389FECH-siRNA
[0074] (1)3389FECH-S3(如SEQ ID 从).6所示）：
[0075] 5 ' CAGGCAAAGAGGAAUUUAUUU 3 '（正义链，第二条链）；
[0076] (2)3389FECH-AS4(如SEQ ID N0.7所示）：
[0077] 3'UUGUCCGUUUCUCCUUAAAUA 5'（反义链，第一条链，与与SEQ ID N0.1 所示序列的 3389~3407位核苷酸互补）。
[0078] (3￡0 10勵.1所不序列的3389~3407位核苷酸：〇&88〇&&&8&88&&1:1^&1:)。
[0079] 实施例2FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后亚铁螯合酶基因的 mRNA表达水平 [0080] 1、细胞培养
[0081 ] (1)人乳腺癌细胞株MDA-MB-435培养液条件为90%DMEM培养基+10%FBS+1%双抗 (青霉素100IU/ml+链霉素100μg/ml)，于恒温细胞培养箱(37°C，5%C02)中培养。
[0082] (2)待细胞生长至85%左右时用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化传代培养。取对 数生长期的细胞用阳离子脂质体转染试剂盒(Transmessenger kit)进行转染。
[0083] 2、细胞转染
[0084] (1)细胞分组，实验共设6组，分别为：
[0085] 1)只加转染剂处理组（阴性对照组）；
[0086] 2)单用O.lmM ALA组；
[0087] 3)50nM PCTsiRNA+O.lmM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA 的混合 siRNAs;
[0088] 4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0089] 5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0090] 6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
[0091] (2)细胞转染siRNA及加ALA处理
[0092] 1)将对数生长期的MDA-MB-435单细胞悬液按2 X105/孔接种至6孔板，用含双链霉 素Penicillin-Streptomycin的完全培养基培养24小时。
[0093] 2)24h后待细胞融合度达到60%进行转染，用转染试剂盒内的buffer将各组siRNA 浓度稀释至0.1ug/yL。按表1所示进行操作：
[0094]表 1
[0097] 3)将以上各组分用移液枪吹打三次混匀，室温（15°C~25°C)，静置5min。
[0098] 4)向以上6组的管中各加入转染剂(Transmessenger)8 ? 8yL。
[0099] 5)用移液枪吹打五次混匀，室温（15 °C~25 °C)，静置1 Omin。
[0100] 6)从细胞培养箱取出六孔板，去掉旧的培养基，用PBS洗两次。
[0101] 7)每孔加500yL DMEM培养基(不含血清不含双抗），然后相应每孔直接加入以上混 合液lOOyL，使得每孔总体积为600yL，混合摇匀。
[0102] 8)在正常培养情况下孵育12h。
[0103] 9)孵育12h后，去除旧的培养基每孔直接加入2ml DMEM完全培养基。
[0104] 10)接种48h后进行二次转染，去除旧的培养基后，操作同上。
[0105] ll)100mM ALA的配制:精确称取 16.76mg的ALA，溶于lml PBS。
[0106] 12)接种72h后，去除旧的培养基，用PBS洗两次，每次2ml。之后加入lml无血清无双 抗的DMEM培养基，相应组加0.1 mM ALA，即从100mM ALA吸取1此，加入ALA后，轻轻摇匀。
[0107] 13)ALA作用4个小时，进行定量PCR。
[0108] 3、荧光定量PCR
[0109] (1)分别利用FECH基因（FECH-1、FECH-2、FECH-3)引物和GATOH引物，进行荧光定量 PCR〇
[0110] 上述引物的序列如下，均由invitrogen公司合成。其核苷酸序列如下所示：
[0111] FECH基因引物：
[0112]上游引物：atggaggtggaagtcaggtg
[0113] 下游引物：gtcatgaggtctcggtccaa
[0114] 内参基因 GAPDH引物：
[0115]上游引物：agcctcaagatcatcagc
[0116] 下游引物：gagtccttccacgatacc
[0117] (2)从转染的细胞中提取总RNA
[0118] 转染72h后，细胞融合度达到90%，按照下面实验步骤提取细胞的总RNA:
[0119] 1)预冷Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇；
[0120] 2)吸掉细胞培养基，用预冷的roS洗2次，加lml Trizol，反复吹打，然后转移至无 RNA酶的1.5ml的EP管中，室温静置5min;
[0121] 3)加200此氯仿，上下用力颠倒15s，室温静置3min;
[0122] 4)离心 12000印111，4。〇，15min;
[0123] 5)吸取上清液至新的1.5ml的EP管中，加异丙醇500此，上下轻柔颠倒15s，室温静 置lOmin;
[0124] 6)离心 12000印111，4。〇，lOmin;
[0125] 7)去掉上清液，加入lml的无水乙醇轻柔漂洗沉淀；
[0126] 8)离心7500印111，4。〇，5min;
[0127] 9)去掉液体，加入lml的80 %乙醇轻柔漂洗沉淀；
[0128] 10)7500rpm,4〇C,5min；
[0129] 11)去掉上清液，干燥RNA 5min;
[0130] 12)加入15yL的0.1%DEPC灭菌水溶解。
[0131] (3)总RNA 逆转录为cDNA
[0132] 1)总RNA浓度的测定：将各个样品稀释50倍，用UV板分别测定每个样品在260nm和 28011111的吸亮度，选择00260/00280的比值为1.7至2.2之间的样品进行下一步实验 ;根据以 下公式计算总 RNA 的浓度：总 RNA(yg/yl) = 40 X 0D260 X 50/1000。
[0133] 2)各样品取50Ong的总RNA按照Takara的逆转录试剂盒prime丨'