scriplSRT Master Mix的说明书，用随机引物进行逆转录成cDNA，于-20°C保存。
[0134] (4)PCR 扩增人 FECH 基因
[0135] 1)将逆转录后的cDNA稀释3倍后，各取liil的cDNA稀释液进行PCR扩增；实验重复3 次。
[0136] 2)扩增体系如下： S YHRMPremix Ex Tacpi酶 5卞L
[0137] cDNA 1pL 上下游引物混合液 0.6 nL
[0138] DEPC 水 3.4 pL 总体积 10 mL
[0139] 其中，上下游引物混合液的终浓度为10iiM。
[0140] 在0.2ml PCR管中加入下列组分后，充分混匀。
[0141] 3)扩增条件如下：95°C30s，40循环(95°C5s、61°C30s)。
[0142] (5) Taqman荧光定量PCR按TaqMan?基因表达试剂盒说明操作。
[0143] 4、实验结果
[0144] 荧光定量PCR检测FECH基因表达水平的结果如附图1所示。图中，从左至右依次为：
[0145] (1 )NCT:只加转染剂处理组（阴性对照组）；
[0146] (2)ALA:单用O.lmM ALA组；
[0147] (3)PCTsiRNA:50nM PCTsiRNA+O.lmM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA 和 3389FECH-siRNA 的混合 siRNAs;
[0148] (4)740siRNA:50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0149] (5)1072siRNA:50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0150] (6)3389siRNA:50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
[0151] 结果显示：PCTsiRNA+O. ImM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1 mM ALA组、50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组，在抑制FECH mRNA表 达方面的作用，分别和只加转染剂处理组及单用O.lmM ALA组比较，均有统计学的明显差异 (P〈0.01)，说明PCTsiRNA+O.lmM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1 mM ALA组、50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组、及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组敲减FECH mRNA表达 的作用明显高于只加转染剂处理组及单用〇 . ImM ALA这两组。而且，PCTs iRNA组敲减FECH mRNA表达的作用明显高于740siRNA、1072siRNA和3389siRNA这三组。
[0152] 实施例3FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后亚铁螯合酶基因的蛋 白表达水平
[0153] 1、本实施例用Western blotting法检测实施例2中各组细胞FECH蛋白表达水平， 方法如下：
[0154] (1)提取总蛋白：收集二次转染后的MDA-MB-435细胞，按照以下方法提取细胞总蛋 白（整个过程在冰上进行）：
[0155] 1)去除培养液，用预冷的PBS洗2次。
[0156] 2)每孔加入加100yl含PMSF的裂解液，用刮刀来回滑动，使裂解液和细胞充分接 触。
[0157] 3)充分裂解后，将细胞裂解液移至500yl的离心管，4°C，12000g离心10分钟，取上 清移至新的离心管。
[0158] 4)用考马斯亮蓝法测定总蛋白的浓度。
[0159] 2、Western blot:按照以下步骤进行western blot:
[0160] 1)制10 %的SDS-PAGE凝胶:先加10 %分离胶，用去离子水密封胶顶部，然后凝固20 分钟;倒掉水，用滤纸吸干，然后加5 %的浓缩胶，迅速插入加样梳，再用浓缩胶液将气泡排 除，再凝固30分钟即可。
[0161] 2) SDS-PAGE电泳:各样品总蛋白上样量为90yg。
[0162] 3)转膜:将滤纸、海绵垫、放置于电转液中，浸泡30-60min，同时准备与大小与凝胶 相同的PVDF膜（蛋白分子量大于100kD用0.45m的PVDF膜，小于100kD的则用0.2wii的PVDF 膜），在甲醇中提前浸泡20s，使PVDF膜半透明，然后用ddH20洗2次，然后放置于转移液中泡 30min，或更久。SDS-PAGE完成后，取下分离胶，将分离胶，PVDF膜以及两层滤纸按顺序放好， 放到放好海绵的黑白板上。（即：从黑色负极端依次从下至上为:海绵垫/滤纸/胶/PVDF膜/ 滤纸/海绵垫。）
[0163] 使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300mA，转膜时间为90分钟。电 转时要释放很多热量，所以槽内要放入专用的冰盒，整个电泳槽置于盛有冰的盆中，叠放顺 序如图2所示。
[0164] 4)封闭：转膜完成后，立即将PVDF膜用TBS洗涤2次，5min/次;膜吸干后放入封闭液 中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90min。封闭结束后，用TBST洗3次，lOmin/次。
[0165] 5)-抗孵育：用TBS頂S制anti-FECH抗体（稀释比为1:300)和anti-GAPDH抗体（稀 释比为1:1000)，将膜放入其中，在摇床上缓慢摇动孵育(常温lh-4°C过夜4常温lh)。孵育 结束后，用TBST洗3次，lOmin/次。
[0166] 6)二抗孵育：用TBST配制相应的二抗(稀释比为1:3000)，将膜放入其中，在摇床上 缓慢摇动孵育(常温2h)。孵育结束后，用TBST洗3次，lOmin/次。
[0167] 7)ECL显影:ECL Western Blotting Substrate reagent试剂盒，A液和B液按1:1 混合两种分光底物，均匀铺在膜上，作用1分钟。用凝胶成像系统ChemiDoc XRS拍照。
[0168] 2、Western Blot结果如附图3所示。图3中，从左至右依次为：
[0169] (1 )NCT:只加转染剂处理组（阴性对照组）；
[0170] (2)ALA:单用O.lmM ALA组；
[0171] (3)740siRNA:50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0172] (4)1072siRNA:50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0173] (5)3389siRNA:50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0174] (6)PCTsiRNA:50nM PCTsiRNA+O.lmM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA 和 3389FECH-S iRNA 的混合 s iRNAs。
[0175] 结果显示：PCTsiRNA+0.1 mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1 mM ALA组、50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组，分别和只加转染剂 处理组及单用O.lmM ALA组比较，对FECH基因在蛋白水平的抑制作用明显增加，均有统计学 的明显差异（P〈〇.〇l) ?说明PCTsiRNA+0.1 mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1 mM ALA组、 50nM1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组、及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组对FECH基因在 蛋白水平的抑制作用远强于只加转染剂处理组及单用〇. ImM ALA组。而且，PCTsiRNA组对 FECH基因在蛋白水平的抑制作用远强于740siRNA、1072siRNA和3389siRNA这三组。
[0176] 实施例4用FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后在细胞内检测到的 PpIX浓度
[0177] 1、细胞培养，同实施例2。
[0178] 2、细胞转染
[0179] (1)细胞分组
[0180]同实施例2，实验共设6组，分别为：
[0181] 1)只加转染剂处理组（阴性对照组）；
[0182] 2)单用O.lmM ALA组；
[0183] 3)50nMPCTsiRNA+0.1 mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-s iRNA 的混合 s iRNAs;
[0184] 4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0185] 5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0186] 6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
[0187] (2)细胞转染siRNA及加 ALA处理，同实施例2,不同之处仅在于在最后ALA作用4个 小时后，是作相关定量检测(而不是定量PCR)。
[0188] 3、荧光定量光谱仪检测
[0189] 荧光定量光谱仪检测转染siRNA和/或加ALA处理后的MDA-MB-435细胞内的PpIX浓 度，结果如附图4所示。图4中，从左至右依次为：
[0190] (1)只加转染剂处理组（阴性对照组）；
[0191] (2)单用O.lmM ALA组；
[0192] (3)50nMPCTsiRNA+0.1mM ALA组：
[0193] 是 740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA 和 3389FECH-siRNA 的混合 siRNAs;
[0194] (4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0195] (5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
[0196] (6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
[0197] 结果显示，用O.lmM的ALA处理后不能诱导明显的PpIX在肿瘤细胞内积聚，但如果 用50nM 3389-FECH-siRNA+O. ImM ALA处理MDA-MB-435细胞，在肿瘤细胞内积聚的PpIX浓度 比单用ALA处理组要高出近50倍。而且，其他两组(50nM 740FECH-siRNA+0.1 mM ALA组、50nM 1072FECH-siRNA+0.1 mM ALA组)也都显著高于单用ALA处理组。
[0198] 因此，分别利用本发明所提供的三个双链siRNA和小剂量ALA联用，均可大幅提高 肿瘤细胞内积聚的Pp IX浓度，而且三个双链s iRNA联用效果更好。
[0199] 4、显微荧光定量检测