一种包载紫杉醇的tpgs-还原性白蛋白纳米粒制剂及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种载药制剂及制备方法，特别是涉及一种包载紫杉醇的蛋白-聚合物结合物制剂及制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症是目前危害人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织统计，2005年到2015期间，已有8400万人死于癌症。同时全球癌症病例呈迅猛增长态势，预计将由2012年的1400万人，逐年递增到2025年的1900万人。新增病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国每年新增癌症患者307万，死亡220万，分别占全球总量的21.9%和26.8%。因此，抗肿瘤药物的市场近年来增长迅速，中国2008年到2013年的复合增长率为20.4%，远高于全球水平。
[0003]化疗仍然是目前临床用于癌症治疗的主要手段之一。而多药耐药现象也是化疗过程中经常面临解决的问题。多药耐药由多种不同机制引导产生，使得药物对肿瘤的治疗不能达到令人满意的效果。之前临床上多采用提高给药剂量的方法克服这一问题，但一般化疗药物有极高的生物毒性，在杀伤肿瘤细胞同时，非选择性地杀伤正常组织细胞，造车严重的用药副作用。因此如何规避肿瘤的多药耐药，靶向性的杀灭肿瘤细胞组织成为研究的热点。
[0004]近年来，纳米给药用于克服肿瘤多药耐药的研究屡见报道。相对于传统的化疗，该方法可降低化疗药物使用剂量，通过被动靶向或外接靶头的方式，将药物输送到肿瘤组织或细胞，达到抗多药耐药和降低毒性的作用，提高化疗药物治疗效果。
[0005]蛋白基纳米给药系统具有无毒无免疫原性、易于生产制备和在贮存和在体内保持稳定等优点，近年来得到广泛的关注。而白蛋白作为一种无毒易于修饰的生物可降解材料更是用于制备纳米载体的优质选择。但是，在使用传统的乳化法或反溶剂法制备白蛋白纳米粒时，发现难以包载疏水性药物，为解决这一问题，研究者在蛋白表面修饰疏水基团或断开蛋白二硫键裸露蛋白中的疏水片段来提高蛋白载体对疏水药物的亲和力。
[0006]肿瘤细胞上过表达的P-gp蛋白等药物外排栗是肿瘤多药耐药的主要原因之一。这些外排转运器可将大多数疏水性抗肿瘤药物栗出肿瘤细胞，抑制其抗肿瘤活性。P-gp蛋白抑制剂也曾被研究用来解决该问题，但小分子的抑制剂却有着低效高毒，改变肿瘤药物药动学特征等诸多问题，并未得到广发的使用。
[0007]TPGS是由维生素E和聚乙二醇1000合成的一种水溶性辅料。其安全性已被FDA证实。TPGS可作为乳化剂、稳定剂、吸收促进剂或载体材料，用于药物制剂。又有研究表明TPGS作为一种高效安全的P-gp蛋白抑制剂可有效提高药物对肿瘤的毒性，提高摄取，延长体内循环时间。而TPGS基纳米给药系统也已被应用于抗肿瘤多药耐药。
[0008]本发明首次合成了兼具TPGS和蛋白优点的生物可降解载体材料，用于疏水性药物紫杉醇的包载。该设计的优势是载体无毒可生物降解，还原性白蛋白提高对紫杉醇的包载效率，而接枝的TPGS可有效抑制肿瘤多药耐药。载体与药物协同达到抗肿瘤作用。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种包载紫杉醇的TPGS修饰还原性白蛋白纳米粒制剂及制备方法，该纳米粒具有提高对紫杉醇的包载效率，有效抑制肿瘤多药耐药，载体与药物协同达到抗肿瘤作用的特点。
[0010]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[00?1 ] 一种包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，该制剂由紫杉醇、合成的TPGS-还原性白蛋白以及注射用水等制成包载紫杉醇的纳米给药系统;其中所述TPGS-还原性白蛋白为0.5-5毫克/毫升，紫杉醇浓度为0.025-1毫克/毫升，紫杉醇和TPGS-还原性白蛋白质量比为1:5-1:20。
[0012]所述的包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，其使用牛血清白蛋白作为载体合成材料，分子量为67kDa。
[0013]所述的包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，其使用TPGS修饰的还原性白蛋白为载体，分子量在67-87kDa。
[0014]—种包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂，其特征在于，所述方法包括以下制备步骤:
[0015](I)合成TPGS修饰的还原性白蛋白
[0016]称取TPGS0.lg(0.065mmol)，丁二酸酐0.013g(0.013mmol)和DMAP 0.08g(0.065mmol)，溶于无水二氯甲烷5ml，氮气保护下，室温反应24h，旋转蒸发除去二氯甲烷，溶于纯水5ml，置于分子量为1000的透析袋以纯水/乙醇(3:1，V/V)水溶液透析24h，冻干处理得 TPGS-C00H。
[0017]称取BSA 200mg，加入PBS缓冲液(pH 8.0)10ml溶解，加入DTT，加入量为BSA中二硫键摩尔量的5倍(约0.04g)，反应4h，使用新沸水透析24h，冻干处理得Re-BSA。
[0018]称取TPGS-COOH69mg，溶于DCM 5ml，加入EDC 0.0lg,NHS 0.006g，(摩尔比1: 1.2:
1.2)，反应8h，室温旋转蒸发抽干DCM，加纯水5ml，超声溶解，备用。称取Re-BSA 50-400mg，溶于I3BS 8.0缓冲液5ml，加入TPGS-C00H-NHS溶液，搅拌反应过夜，使用纯水/乙醇(9:1)透析48h，冻干。
[0019](2)制备包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒
[0020]采用超声透析方法制备包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒，取TPGS-还原性白蛋白适量加入注射用水，超声分散成空白纳米粒。
[0021]取空白纳米粒5毫升，搅拌下向其迅速滴加紫杉醇的乙醇溶液I毫升。
[0022]然后上述溶液在低强度(200W)下超声10分钟，转移到分子量为14000的透析袋，使用纯水透析24小时，得到产物在4°C、14000转/分钟条件下离心30min，除去离心上清液，再用蒸馏水重复洗涤离心两次，所得纳米粒漩涡分散，得到载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒。
[0023 ]所述的一种包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂的制备方法，步骤(I)中所述合成的TPGS-还原性白蛋白投料比TPGS:Re-BSA为I: 1_1:8，优选为1:1_1:2。
[0024]所述的一种包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂的制备方法，步骤(2)所述TPGS-还原性白蛋白空白纳米粒浓度为0.5-5毫克/毫升，优选为1-2毫克/毫升。
[0025]所述的一种包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂的制备方法，步骤(2)所述紫杉醇浓度为0.025-1晕克/晕升，优选为0.05-0.1_克/晕升。
[0026]所述的一种包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂的制备方法，步骤(2)所述紫杉醇与TPGS-还原性白蛋白纳米粒质量比为I: 5-1: 20，优选为1:10-1:20。
[0027 ]包载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂是超声分散法自组装空白TPGS-还原性白蛋白纳米粒，再通过超声透析的方法将紫杉醇包载在纳米粒中，形成纳米制剂。
[0028]本发明的优点与效果:
[0029]1、本发明制备的载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒是一种淡蓝色至乳白色的胶状溶液制剂，可用于乳腺癌、肺癌、恶性胶质瘤的治疗。
[0030]2、本发明所制得的载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂，其具有高载药效率和抗肿瘤多药耐药的特性，在注射后再血液循环保持稳定，通过EPR效应输送到肿瘤部位，同时载体具有抑制P-gp蛋白外排的作用，可以有效克服肿瘤的多药耐药，达到与药物协同作用的效果。
[0031]3、本发明通过工艺优化和处方筛选成功地制备了载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒。透射电镜观察纳米粒具有球型外观，平均粒径在200nm左右。Zeta电位结果表明纳米粒子结构稳定。
[0032]4、本发明制备了具有高载药量和抗肿瘤多药耐药的药TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂，生物相容性好，制成注射剂后具有良好的缓释性和肿瘤靶向性，可提高紫杉醇的治疗效果，减少使用剂量，降低其毒副作用，利于提高患者治疗的耐受性。
【具体实施方式】
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[0033]下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0034]实施例1制备载紫杉醇的TPGS-还原性白蛋白纳米粒制剂
[0035](I)称取TPGS 0.18(0.065臟01)，丁二酸酐0.0138(0.01311111101)和01^? 0.08g(0.065mmol)，溶于无水二氯甲烷5ml，氮气保护下，室温反应24h，旋转蒸发除去二氯甲烷，溶于纯水5ml，置于分子量为1000的透析袋以纯水/乙醇(3:1，V/V)水溶液透析24h，冻干处理得 TPGS-C00H。
[0036]称取BSA 200mg，加入PBS缓冲液(pH 8.0)10ml溶解，加入DTT，加入量为BSA中二硫键摩尔量的5倍(约0.04g)，反应4h，使用新沸水透析24h，冻