>[0185] P⑶H:5'-GGGAGGAAAUUGCUGUUCATT-3'（SEQ ID N0:1)，
[0186] PSPH :5'-GGAGUAUUGUAGAGCAUGUTT-3'（SEQ ID N0:2)。
[0187] 转染方法利用罗氏公司X-tremeGene siRNA转染试剂进行转染。
[0188] 重组腺病毒的构建和应用
[0189] 人源过表达PSATl腺病毒通过Qbiogene的AdEasy腺病毒载体系统构建。构建方 法为：以 F :CGGAATTCCGATGGACGCCCCCA(SEQ ID N0:3)，R :GGAAGATCTCTCATAGCTGATGCATCTC CA (SEQ ID N0:4)为引物扩增获得人PSATl序列，插入到AdEasy腺病毒载体系统中。对照 为过表达绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP)。
[0190] Knock down腺病毒利用Invitrogen的BLOCK-iT腺病毒RNAi表达系统构建。用 于Knock down的序列如下：
[0191] 针对鼠源 PSATl (用于构建 Ad-shPSATl) :5' -GCATCAGTGTGCTCGAAA TGA-3'（SEQ ID NO:5)，
[0192] 对照组 scrambled :5' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（SEQ ID NO:6)，
[0193] 针对鼠源 TRB3(用于构建 Ad-shTRB3) :5'-GGAACCTTCAGAGCGACTT GT-3'（SEQ ID NO:7)〇
[0194] 高滴度的重组腺病毒利用氯化铯密度梯度离心的方法纯化获得。离心得到的病毒 进行透析之后，_80°C储存。处理细胞时，12孔板每孔10 7pfu，动物实验中，尾静脉注射每只 小鼠 IO9Pfu。
[0195] 血糖、血清胰岛素的测定、葡萄糖耐受实验（GTT)和胰岛素耐受实验（ITT)
[0196] 血糖的测定是从小鼠尾部采血，用Glucometer Elite monitor检测血糖。血清中 膜岛素含量使用ALPCO Diagnostic公司的Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA kit检测。
[0197] 葡萄糖耐受测试（GTT) :C57BL/6小鼠饥饿过夜后腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液，分 别在0,15, 30,60,120分钟时用利舒坦快速血糖检测仪和试纸条检测血糖。
[0198] 胰岛素耐受测试（ITT) :C57BL/6小鼠饥饿4小鼠后腹腔分别注射0. 75U/kg胰岛 素，分别在〇, 15, 30,60,120分钟时用利舒坦快速血糖检测仪和试纸条检测血糖。
[0199] 胰岛素抵抗指数（HOMA-IR)的计算为[空腹血糖水平（mmol/L)] X [空腹血清胰 岛素 （U U/ml) ]/22· 5。
[0200] 血清及肝脏中丝氨酸水平检测
[0201] 通过Beckman 6300automated氨基酸分析仪分析。
[0202] 体内胰岛素信号通路的检测
[0203] 小鼠饥饿6小时之后，腹腔注射水合氯醛将其麻醉，分别取比目鱼肌，脂肪和肝脏 组织各一小块，液氮冷冻后放入_80°C冰箱保存备用，然后从小鼠肝门静脉注射2U/kg胰岛 素3,4, 5分钟后分别取另一侧的肝脏，脂肪和比目鱼肌各一小块，液氮冷冻后放入-80°C冰 箱保存备用。
[0204] 蛋白提取
[0205] 50mg左右的组织或贴壁细胞用PBS洗两遍并吸尽残余的PBS，加适量体积的混有 蛋白酶抑制剂和磷脂酶抑制剂的变性RIPA裂解液（150mM NaCl，IOmM Tris pH7. 2,0.1 % SDS，l%Triton X-100，l%Deoxycholate，5mM EDTA)，冰上充分裂解后转移至 EP 管。4°C， 12000g离心20分钟，取上清。
[0206] 用Pierce公司的BCA Kit测蛋白浓度。测完浓度后，加4X SDS上样缓冲液（200mM Tris-Cl，ρΗ6·8,8% SDS，0.4%溴酚蓝，40%甘油，400mM DTT)，100°C煮 10 分钟，立即上样 进行免疫印迹检测或_20°C贮存。
[0207] 免疫印迹
[0208] 根据蛋白分子量的不同，选用适合浓度的不连续变性聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE) 进行垂直电泳，一般为10%。常规方法进行免疫印迹检测。
[0209] 一 抗抗体：anti_phosphorylated (p)-IR (tyrl 150/1151)，anti-IR， anti-p-IRSl (tyrosine 612/608-human/mouse)，anti-IRSl，anti-p-PDKl (ser241)， anti-FOKLanti-p-AktCserATShanti-Aki^anti-p-GSK^P (ser9)和 anti_GSK30 均购自 Cell Signaling Technology 公司，anti-PSATl 和 anti_TRB3 购自 Santa Cruz 公司。
[0210] RNA提取及实时定量荧光PCR
[0211] 基因水平检测采用常规方法，具体的引物序列如下：
[0212] PSATl 正向引物，5' -ACGCCAAAGGAGACGAAGCT-3'（SEQ ID N0:8)，
[0213] PSATl 反向引物，5' -ATGTTGAGTTCTACCGCCTTGTC-3'（SEQ ID N0:9)。
[0214] 统计分析
[0215] 数值均以均值土标准差表示，每个实验中每组包含的小鼠数目都在图示中说明。 两组间差别是否具有统计学意义采用非配对组间双尾t检验进行检测，三组或四组间的差 别用 one-way ANOVA 检测后再用 Student-Newman-Keuls test。当 ρ〈0· 05 时，认为组间有 统计学差异。
[0216] 实施例1、体外PASTl调节胰岛素敏感性
[0217] 为了研究PASTl是否参与胰岛素敏感性的调节，本发明人用PASTl腺病毒 (Ad-PSATl)以及对照病毒绿色荧光蛋白（Ad-GFP)感染人肝脏肿瘤细胞H印G2和小鼠肝脏 原代细胞，检测这两种细胞中胰岛素通路的变化。本发明人发现，在两种细胞中，与对照组 相比，过表达PSATl增加了胰岛素刺激的蛋白激酶B (AKT) 473位点丝氨酸的磷酸化，糖原合 成激酶3 β (GSK-3 β ) 9位点丝氨酸的磷酸化（图1A)。
[0218] 本发明人用针对PSATl编码区域的小发夹RNA的腺病毒（AchshPSATl)以及对 照病毒scrambled感染人肝脏肿瘤细胞HepG2和小鼠肝脏原代细胞，发现与对照组相比， Ad-shPSATl减少了内源的PSATl蛋白水平，降低了胰岛素刺激的蛋白激酶B(AKT)473位 点丝氨酸的磷酸化，糖原合成激酶3 β (GSK-3 β )9位点丝氨酸的磷酸化（图1B)。但是， Ad-PSATl或Ad-shPSATl并没有影响胰岛素刺激的胰岛素受体（IR) 1150/1151位点酪氨酸 的磷酸化，胰岛素受体底物I (IRSl) 612/608-人/鼠位点酪氨酸的磷酸化，磷酸肌醇依赖的 蛋白激酶I O3DKl) 241位点丝氨酸的磷酸化（图IA和IB ;图IOA和10B)。此外，在基础状态 或者胰岛素刺激情况下，过表达PASTl减少了葡萄糖产出，增加了糖原含量（图IC和1D)。
[0219] 实施例2、体内过表达PSATl提高胰岛素敏感性
[0220] 为了探索体内PSATl对胰岛素敏感性的作用，本发明人在雄性C57BL/6J野生型 (WT)小鼠中，通过尾静脉注射Ad-PSATl或Ad-GFP，发现与对照组相比，Ad-PSATl组的小鼠 肝脏中PSATl基因和蛋白水平显著上升（图2A)。虽然Ad-PSATl组的小鼠体重和摄食没有 变化，但是进食和饥饿状态下血糖显著降低（图2B)。饥饿血清中胰岛素水平没有变化，进 食血清中胰岛素水平显著降低（图2C)。并且，HOMA-IR指数显著降低（图2D)。
[0221] 小鼠尾静脉注射Ad-PSATl或者Ad-shPSATl之后，摄食和体重均没有显著变化 (图 11A-D) 〇
[0222] 本发明人分别通过葡萄糖耐受实验（GTTs)和胰岛素耐受实验（ITTs)检测了小 鼠葡萄糖耐受和清除效率。结果发现，在改变体内葡萄糖或胰岛素水平时，与对照组相比， Ad-PSATl组的小鼠血糖下降得更快（图2E)。与体外结果（图1A) -致，Ad-PSATl组的小 鼠肝脏中，胰岛素刺激的AKT和GSK3 β的磷酸化显著上升，而IR，IRSl和TOKl的磷酸化 没有变化（图2F和图10C)。相比之下，Ad-PSATl组的小鼠白色脂肪组织（WAT)和肌肉中， PSATl的表达以及胰岛素通路没有变化（图12Α和12Β)。
[0223] 实施例3、体内敲减PASTl损害胰岛素敏感性
[0224] 实施例2的结果提示，敲减PSATl可能减弱胰岛素敏感性。为了验证这个假 设，本发明人在雄性C57BL/6J野生型（WT)小鼠中注射了 Ad-shPSATl或Ad-scrambled。 Ad-shPSATl组的小鼠肝脏中PSATl基因和蛋白水平显著下降（图3A)。虽然Ad-shPSATl 组的小鼠体重和摄食没有变化，但是进食和饥饿状态下血糖显著升高（图3B)。因此，尽管 进食和饥饿时血清中胰岛素水平没有变化，Ad-shPSATl组的小鼠 HOMA-IR指数还是显著升 高（图3C和3D)。与这些结果一致，本发明人分别通过GTTs和ITTs发现，Ad-shPSATl组 的小鼠葡萄糖耐受和清除效率降低（图3E)。Ad-shPSATl组的小鼠肝脏中，胰岛素刺激的 AKT和GSK3 β的磷酸化显著下降，而IR，IRSl和I3DKl的磷酸化没有变化（图3F和图10D)。 Ad-shPSATl组的小鼠白色脂肪组织（WAT)和肌肉中，PSATl的表达以及胰岛素通路依旧没 有变化（图12C和12D)。
[0225] 实施例4、db/db小鼠肝脏中PSATl表达下降，过表达PSATl后改善了胰岛素敏感 性
[0226] 本发明人进一步探索了 PSATl是否参与胰岛素抵抗。首先检测了胰岛素抵抗小 鼠肝脏中PSATl的表达。用了两种胰岛素抵抗模型：遗传模型即瘦素受体缺失（db/db) 小鼠 （Kodama H等，Diabetologia 1994;37:739-744)和营养诱导模型即高脂饮食诱导 (Winzell MS等，Diabetes 2004 ;53Suppl 3:S215-219)。这些小鼠的各个参数表明体内胰 岛素抵抗。本发明人惊喜地发现，与对照组相比，在db/db小鼠和高脂饮食诱导16周的小 鼠肝脏中，PSATl表达显著降低，而在其他组织包括WAT和肌肉中没有变化（图4A和4B ;图 13A 和 13B)。
[0227] 为了研究PSATl表达的降低是否是造成db/db小鼠胰岛素抵抗的原因，本发明人 在db/db小鼠中注射了 Ad-PSATl或Ad-GFP，检测过表达PSATl是否能够回复db/db小鼠的 胰岛素抵抗。和预期一样，与对照组相比，Ad-PSATl组db/db小鼠肝脏中PSATl表达显著升 高（图5A)。在db/db小鼠中过表达PSATl同时能够显著降低进食和饥饿血糖，进食时血清 中胰岛素以及HOMA-IR指数，除了饥饿时血清中胰岛素水平没有变化（图5B-D)。GTT和ITT 表明Ad-PSATl组db/db小鼠的葡萄糖清除能力和胰岛素敏感性提高（图5E)。Ad-PSATl 组db/db小鼠肝脏中，胰岛素刺激的AKT和GSK3 β的磷酸化显著升高，IR的磷酸化没有变 化。
[0228] 为了在HFD诱导的胰岛素抵抗模型中进一步验证，本发明人在HFD或者正常饮 食14周的小鼠中注射Ad-PSATl或Ad-GFP，并保持HFD或者正常饮食。与对照组相比， Ad-PSATl组小鼠肝脏中PSATl表达显著升高（图6A)。与正常饮食组相比，HFD显著导致 胰岛素敏感性降低，进食和饥饿时血糖和血清中胰岛素升高，HOMA-IR指数升高，葡萄糖和 胰岛素耐受以及肝脏中胰岛素信号通路减弱（图6B-F)。以上参数表明HFD小鼠胰岛素敏 感性损害，但是能够通过注射Ad-PSATl大幅度回复，除了血清中胰岛素水平（图6B-F)。
[0229] 实施例5、PSATl通过TRB3影响胰岛素敏感性
[0230] 本发明人猜测PSAT1，作为调节丝氨酸生物合成的关键酶，可能通过TRB3调节胰 岛素敏感性。和预期一致，本发明人分别在体内体外发现，Ad-PSATl可以显著降低TRB3， Ad-shPSATl可以显著升高TRB3 (图7A和7B)。同时，与对照组相比，db/db小鼠和HFD小 鼠肝脏中TRB3表达显著升高，而在WAT和肌肉中没有变化（图7C，图13A和13B)。非免疫 鼠源肝脏肿瘤细胞H印1-6,是研究胰岛素信号通路的常用细胞，为了探索了 TRB3是否参与 PSATl调节胰岛素信号通路，本发明人在H印1-6中感染了 Ad-shPSATl和针对TRB3编码区 域的小发夹RNA的腺病毒（Ad-shTRB3)以及对照病毒scrambled。和预期一致，敲减TRB3 后，可以显著回复Ad-shPSATl对胰岛素激活的AKT和GSK3 β的磷酸化的抑制，但是IR的 磷酸化没有变化（图7D)。
[0231] 为了进一步研究体内TRB3是否参与PSATl调节胰岛素敏感性，本发明人在小鼠体 内注射了 Ad-