一种包裹细胞生长因子的脂质磷酸钙纳米粒的制备及应用
【专利摘要】本发明公开了一种脂质体磷酸钙纳米粒(Lipide calcium phosphate nanoparticles LCP NP)，具体是以脂质体包裹的磷酸钙纳米粒为载体及传递介质，在其中包裹细胞生长因子(FGF)制备成化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂或膏霜剂。所述组合物具有滋润、保湿、修复、抗衰的作用，脂质体磷酸钙纳米粒还能使携带的活性成分深入深层皮肤，活化深层皮肤细胞，起到重建皮肤屏障，修复敏感肌肤，抗皱嫩肤的作用。
【专利说明】
-种包裹细胞生长因子的脂质磯酸巧纳米粒的制备及应用
技术领域
[0001] 本发明提供一种W脂质磯酸巧核必的组合物，具体是W脂质体磯酸巧纳米粒为主 要材质，其可单独使用，和/或作为载体及传递介质，包裹细胞重组人成纤维细胞生长因子 (FGF)生物活性蛋白制备成化妆品原料或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、 乳剂、凝胶剂、膏霜剂。属于美容护肤品的技术领域。 技术背景
[0002] 生物护肤品的主要成分生物活性多肤大部分是细胞生长因子，而成纤维细胞生长 因子（FGF)无疑是当中的伎伎者。它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理 功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、 增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃瘍W及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要 作用。但是皮肤致密的屏障功能使大分子FGF的经皮吸收率低，无法发挥其优良的生物活 性。提高FGF体外皮肤给药的生物利用度一直是生物美容领域亟待解决的一个关键问题。
[0003] 现代制剂技术水平的提高，微囊包裹技术在医药行业的广泛运用，然而因其 在外用皮肤给药方面的显著优势也使其近年来在化妆品行业崭露头角。脂质磯酸 巧化(P)纳米粒是一种新型的基因转染非病毒载体，已经不仅成功用于体外将核酸递 送入细胞内并表达，且有报道用于负载吉西他滨和Trp2多肤等抗肿瘤成分能显著地 增强其抑制肿瘤细胞增殖的作用[Zhang Y，Kim WY，Huang L. Systemic delivery of gemcit曰bine triphosphate vi曰 LCP nanoparticles for NSCLC 曰nd pancreatic cancer therapy [Jl.Biomaterials，2013, 34(13) ;；3447 ~；3458 ;Xu Z, Ramishetti S, Tseng YC,. Multifunctional nanoparticles co-delivering trp2peptide and CPG adjuvant induce potent cytotoxic t-lymphocyte response 曰g曰inst mel曰nom曰曰nd its lung metastasis[J].J Control Release, 2013,172(1) :259 ~26 引。该纳米粒不但具备了脂质 体和磯酸巧良好的生物粘附性和生物相容性，生物利用度及安全性高等特点，而且改变了 单纯磯酸巧纳米粒容易聚合的特点，大大提高了大分子活性成分的包封率和稳定性，从而 提高内含活性成分的疗效。
[0004] 本发明公开了一种W脂质磯酸巧纳米粒为核必的组合物，具体是W脂质磯酸巧纳 米粒作为载体及传递介质，包裹细胞生长因子（FG巧生物活性蛋白制备而成的化妆品原料 或活性添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。具有滋润、保湿、 巧角质、抗衰、抗氧化的作用。与市场上现有的产品比较，本发明的脂质磯酸巧纳米粒还能 使携带的活性成分深入深层皮肤，清除皮肤内部自由基，活化深层皮肤细胞，特别适用于敏 感肌肤，起到重建表皮，修复敏感肌肤，抗皱嫩肤的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了一种W脂质磯酸巧纳米粒的组合物，具体是W脂质磯酸巧纳米粒作 为载体及传递介质，包裹细胞生长因子（FG巧生物活性蛋白制备而成的化妆品原料或活性 添加成分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。所述组合物具有滋润、保 湿、修复的作用，脂质体磯酸巧纳米粒还能使携带的活性成分深入深层皮肤，活化深层皮肤 细胞，起到重建皮肤屏障，修复受损及敏感肌肤，抗皱嫩肤的作用。
[0006] 在本发明的第一个方面，提供了一种W脂质磯酸巧为核必的组合物，其包含1~ 50重量％的脂质体，1~50重量％磯酸巧，0. 0001~1重量％的细胞生长因子FGF。
[0007] 其中所述脂质磯酸巧是W纳米粒的形态存在，其粒径为50nm~200nm。
[0008] 其中所述的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人 FGF(rhFGF)。主要包括重组人酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF)，和重组人碱性成纤维细 胞生长因子（riibFG巧中的一种。所述重组人酸性成纤维细胞生长因子（rhaFG巧的氨基酸 序列（GenBank N0;AAB29057. 2)。所述的重组人碱性成纤维细胞生长因子（riibFG巧的氨 基酸序列为（GenBank NO ;AAB21432. 2)。
[0009] 在本发明的第二个方面，提供了一种脂质磯酸巧纳米粒为载体的包裹FGF的活性 半成品及其制备方法。
[0010] 其中所述包裹FGF脂质磯酸巧纳米粒的制备方法为：
[0011] (1)将表面活性剂、助表面活性剂和有机溶剂A按照混合，构成油相Η元体系。将 氯化巧水溶液（10~250mM)、磯酸盐水溶液（10~250mM) W及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/ mL)混合，制成水化将水相缓慢加入油相充分揽拌，制成油包水的微乳，室温静置5~ 15min产生磯酸巧沉淀，将巧樣酸钢溶液巧~50mM)逐滴加入微乳中，揽拌混合均匀，体系 又恢复澄清透明。微乳过Ig 60~200目的硅胶填充的硅胶柱，用体积比1~5 : 1的己 醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪挥干己醇后即得磯酸巧纳米粒水溶液。
[0012] (2)取磯脂和胆固醇按1~10 : 1混合，溶于有机溶剂B中，于5(TC旋转蒸发，除 去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸傭水室温赔育0. 5~化，过0. 22 μ m微孔滤 膜，得到脂质体溶液。
[001引 做将（1)、似巧[J备所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[0014] 步骤（1)中所述的有机表面活性剂为泊洛沙姆、聚己二醇辛基苯基離、十二烷基 硫酸钢或聚山梨醇中的一种或几种；
[0015] 所述的助表面活性剂为正己醇、丙二醇、丙Η醇、己醇、异丙醇中的一种或几种；
[0016] 所述的有机溶剂A为环己焼、正己焼、正辛焼中的一种；
[0017] 所述的表面活性剂；助表面活性剂：有机溶剂A=1~5 : 1~5 : 1~5。
[0018] 所述的磯酸盐水溶液为磯酸二氨钢、磯酸氨二钢、Η聚磯酸钢中的一种或几种。
[0019] 所述的riiFGF为重组人成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组 人FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子（rhaFG巧和碱性成纤维细胞生长因子 (riibFG巧中的一种。
[0020] 所述的氯化巧水溶液：磯酸盐水溶液：FGF水溶液=10~200 : 10~ 200 : 10 ~50。
[0021] 步骤（2)中所述的有机溶剂B为氯仿、二氯甲焼、己醇中的一种或几种混合；
[0022] 所述的磯脂为大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、 1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DS阳-PEG2000)中的一种或几种，优选1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0023] 所述的包裹FGF脂质磯酸巧纳米粒亦可通过W下制备方法获得：
[0024] (1)将氯化巧水溶液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL) W及油相混合， 作为混合液A。将磯酸溶液（10~50mM，pH = 9. 0)，油相W及磯脂混合，作为混合液B。将 A、B混合20min，加入10~50血己醇，12000g离必5~30min，己醇洗2-3遍后挥干己醇， 加1~lOmL去离子水制成包含FGF的磯酸巧纳米粒混悬液。
[00巧](2)取磯脂和胆固醇按1~10 : 1混合，溶于有机溶剂B中，于5(TC旋转蒸发，除 去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸傭水室温赔育0. 5~化，过0. 22 μ m微孔滤 膜，得到脂质体溶液。
[002引 做将（1)、似巧[J备所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[0027] 步骤（1)中所述的油相为环己焼/壬基酪聚氧己帰離巧0-80% : 50-20% )。氯 化巧水溶液；FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~30。
[0028] 所述的磯酸盐水溶液为磯酸二氨钢、磯酸氨二钢、Η聚磯酸钢中的一种或几种。
[0029] 所述的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人 FGF(rhFGF)。主要包括酸性成纤维细胞生长因子（rhaFG巧和碱性成纤维细胞生长因子 (riibFG巧中的一种。
[0030] 步骤（1)中所述的磯脂为1,2-油醜磯脂酸值0PA)，1,2-二油醜基磯脂醜胆碱 值0PC)、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧中的一种，优选1,2-油醜磯脂酸值0PA)。
[0031] 所述的磯酸盐水溶液：油相：磯脂=0. 05~1 : 10~30 : 0. 05~1。
[0032] 步骤（2)中所述的有机溶剂为氯仿、二氯甲焼、己醇、己離中的一种或几种混合；
[0033] 所述的磯脂为大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、 1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0034] 本发明所述包裹细胞生长因子的脂质磯酸巧纳米粒可进一步制备成泡沫剂、水 剂、乳剂、凝胶剂或膏霜剂。
[0035] 因此，本发明提供下述：
[0036] 1. -种W脂质磯酸巧纳米粒为核必的组合物，其包含1~50重量％的脂质体， 1~50重量％磯酸巧，0. 0001~1重量％的细胞生长因子FGF。
[0037] 2.根据第1项所述的组合物，其中所述脂质磯酸巧纳米粒的粒径为lOOnm~ 500nm。
[0038] 3.根据第1项所述的组合物，其中FGF为通过基因工程技术获得的重组人 FGF (rhaFGF 和 rlAFG巧。
[0039] 4.根据第1项所述的组合物，其中所述脂质体磯酸巧W纳米粒形式存在，所述纳 米粒负载有FGF，形成包裹有FGF的脂质体磯酸巧米粒，其制备方法为；（1)将表面活性剂、 助表面活性剂和有机溶剂A按照混合，构成油相Η元体系。将氯化巧水溶液（10~250mM)、 磯酸盐水溶液（10~250mM) W及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/mL)混合，制成水相，将水相缓 慢加入油相充分揽拌，制成油包水的微乳，室温静置5~15min产生磯酸巧沉淀，将巧樣酸 钢溶液巧~50ml)逐滴加入微乳中，揽拌混合均匀，体系又恢复澄清透明。微乳过Ig 60~ 200目的硅胶填充的硅胶柱，用体积比1~5 : 1的己醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪 挥干己醇后即得磯酸巧纳米粒水溶液。（2)取磯脂和胆固醇按1~10 : 1混合，溶于有机 溶剂B中，于5(TC旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸傭水室温赔 育0. 5~化，过0. 22 μ m微孔滤膜，得到脂质体溶液。（3)将（1)、（2)制备所得的溶液按照 0. 1~10 : 1混合即得。
[0040] 5.根据第4项步骤（1)中所述的有机表面活性剂为泊洛沙姆、聚己二醇辛基苯基 離、十二烷基硫酸钢或聚山梨醇中的一种或几种；所述的助表面活性剂为正己醇、丙二醇、 丙Η醇、己醇、异丙醇中的一种或几种；所述的有机溶剂A为环己焼、正己焼、正辛焼中的一 种；所述的磯酸盐水溶液为磯酸二氨钢、磯酸氨二钢、Η聚磯酸钢中的一种或几种。所述的 riiFGF为重组人成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主 要包括酸性成纤维细胞生长因子（rhaFG巧和碱性成纤维细胞生长因子（riibFG巧中的一 种。步骤（2)中所述的有机溶剂B为氯仿、二氯甲焼、己醇中的一种或几种混合；所述的磯 脂为大豆磯脂、卵磯脂、氨化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、1，2-二油帰氧基3-Η甲 氨基丙焼值0ΤΑΡ)、聚己二醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺值SPE-PEG2000)中的一种或几 种，优选1,2-二油帰氧基3-Η甲氨基丙焼值0ΤΑΡ);
[0041] 6.根据第1项所述的组合物，其还可W通过下述制备所得；（1)将氯化巧水溶 液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL) W及油相混合，作为混合液Α。氯化巧水溶 液：FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~30。将磯酸溶液（10~50mM，pH = 9. 0)，油相W及磯脂混合，作为混合液B。磯酸盐水溶液：油相：磯脂=0. 05~1 : 10~ 30 : 0. 05~1。将A、B混合20min，加入10~50血己醇，12000g离必5~30min，己醇洗 2- 3遍后挥干己醇，加1~10血去离子水制成包含FGF的磯酸巧纳米粒混悬液。（2)取磯 脂和胆固醇按1~10 : 1混合，溶于有机溶剂B中，于5(TC旋转蒸发，除去有机溶剂，形成 均匀脂质薄膜。加入同温的蒸傭水室温赔育0. 5~化，过0. 22 μ m微孔滤膜，得到脂质体溶 液。做将（1)、似巧[J备所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。
[004引 7.根据第6项步骤（1)中所述的油相为环己焼/壬基酪聚氧己帰離 巧0-80% : 50-20% )。氯化巧水溶液：FGF水溶液：油相=0. 05~1 : 0. 05~1 : 10~ 30。所述的磯酸盐水溶液为磯酸二氨钢、磯酸氨二钢、Η聚磯酸钢中的一种或几种。所述 的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF(rhFGF)。主要包括 酸性成纤维细胞生长因子（rhaFG巧和碱性成纤维细胞生长因子（riibFG巧中的一种。步骤 (1)中所述的磯脂为1,2-油醜磯脂酸值0PA)，1,2-二油醜基磯脂醜胆碱值0PC)、二油醜基 磯脂醜己醇胺值0P巧中的一种，优选1,2-油醜磯脂酸值0PA)。步骤（2)中所述的有机溶 剂为氯仿、二氯甲焼、己醇、己離中的一种或几种混合；所述的磯脂为大豆磯脂、卵磯脂、氨 化磯脂、二油醜基磯脂醜己醇胺值0P巧、1,2-二油帰氧基3-H甲氨基丙焼值0TAP)、聚己二 醇2000-二硬脂醜磯脂醜己醇胺值S阳-PEG2000)中的一种或几种，优选1,2-二油帰氧基 3- H甲氨基丙焼值0TAP);
[0043] 8.第1-7项中任一项所述的脂质磯酸巧组合物可作为化妆品原料或活性添加成 分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。
[0044] 9.根据第8项所述的脂质磯酸巧纳米粒在其它制剂中的添加量为1~5重量％。
[0045] 10. -种皮肤修护系列化妆品，其包含有效量的1-9项中任一项的包裹细胞生长 因子的脂质磯酸巧纳米粒组合物。
[0046] 与现有技术相比，本发明所述的一种包裹FGF的脂质磯酸巧纳米粒具有下述优 点：
[0047] 1、细胞生长因子常温稳定性差，易降解，易失活；生物利用率低、半衰期短、代谢迅 速等特点，在常规剂型应用中存在诸如稳定性差，给药方式单一、用药损伤大、生物利用度 低等众多特点。由于稳定性的限制，市售的FGF主要有冻干制剂和液体制剂，其他剂型较为 少见。磯酸巧W其良好的稳定性目前已被广泛应用于口腔正崎护理、骨替代物、药物递送材 料及血管支架中，而脂质体近年来也同样被广泛利用于多肤和蛋白的载体。W脂质包裹磯 酸巧纳米粒为载体极大程度地提高FGF的稳定性。
[0048] 2、脂质体与磯酸巧均为缓释制剂载体，使内含物缓慢释放，延长内含物作用时间， 在细胞内外持久的发挥作用。减少使用量，提高使用安全性。
[0049] 3、极高的组织相容性，脂质磯酸巧纳米粒增加皮肤对FGF的吸收，外层脂质的生 物膜类似结构与皮肤角质层磯脂结构相互作用，改变角质层对药物的屏障作用，通过吸附、 融合等方式将药物释放到皮肤细胞间隙。
【附图说明】
[0050] 附图1FGF脂质磯酸巧纳米粒制备流程图。
[0051] 附图2FGF脂质磯酸巧纳米粒制备流程图。
[0052] 附图3Bal b/c 3T3细胞增殖实验倒置显微镜下（40X)细胞状态图对比。（1)为 aFGF脂质磯酸巧纳米粒组；（2)为空白对照组。（1)组比（2)组细胞显著增加。表明aFGF 在制备成脂质磯酸巧纳米粒后仍然保持极高的增值活性。
[0053] 附图4Bal b/c 3T3细胞增殖实验细胞增殖情况对比图。
[0054] 附图5aFGF脂质磯酸巧纳米粒与aFGF原液稳定性比较。（1)为4°C条件下存放时 两种样品的活性变化；（2)为25Γ条件下存放时两种样品的活性变化；（3)为4(TC条件下 存放时两种样品的活性变化。
【具体实施方式】
[0055] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发 明并不限于送些具体的实施例。
[0056] 本领域技术人员应该理解，如无特别说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分 析纯级别的试剂。
[0057] 实施例1FGF脂质磯酸巧纳米粒的制备（方法一）
[0058] (1)将聚己二醇辛基苯基離灯riton X-l)2. 52mL、正己醇1. 68mL、环己焼2. 8血混 合，构成油相Η元体系7血。将250mM氯化巧水溶液100 μ L，250mM磯酸氨二钢100 μ L W 及25 μ L0.1 mg/mL的aFGF或bFGF混合，制成水相，将水相缓慢加入油相充分揽拌，制成油 包水的微乳，室温静置15min产生磯酸巧沉淀，将125 μ L 15mM的巧樣酸钢溶液逐滴加入微 乳中，揽拌混合均匀，体系又恢复澄清透明。微乳过Ig 60~200目的硅胶填充的硅胶柱， 用体积比3 : 1的己醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪挥干己醇后溶于5mL的蒸傭水中。
[0059] 似取D0TAP (购自西安瑞樓生物科技有限公司）与胆固醇按质量比4 : 1的比例 混合，溶于无水己醇5mL中，于5(TC旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温 的5mL蒸傭水水合化，过0. 22 μ m微孔滤膜，得到脂质体溶液。
[0060] 做将（1)、似巧[J备所得的溶液按照1 : 1的体积混合即得aFGF或bFGF脂质磯 酸巧纳米粒。
[0061] 实施例2FGF脂质磯酸巧纳米粒的制备（方法二）
[0062] (1)取 300 μ L 500mM 的氯化巧水溶液，100 μ L 2mg/mL aFGF 或 bFGF 溶液，15血环 己焼/壬基酪聚氧己帰離（71 : 29)混合作为溶液A。将300 μ L25mM磯酸氨二钢溶液（pH =9. 0),15血环己焼/壬基酪聚氧己帰離（71 : 29)混合后加入200uL，20mg/血D0PA(购 自西安瑞樓生物科技有限公司）揽拌均匀作为溶液B。将溶液A和溶液B混合20min，加入 30血己醇，12000g离必15min，己醇洗2~3遍后挥干己醇，用1血去离子水溶解。即得包 含FGF的磯酸巧纳米粒混悬液。
[006引 似取D0TAP与胆固醇（均购自西安瑞樓生物科技有限公司）按质量比4 : 1的 比例混合，溶于无水己醇中，于5(TC旋转蒸发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入 同温的5mL蒸傭水水合化，过0. 22 μ m微孔滤膜，得到脂质体溶液。
[0064] (3)将500 μ L磯酸巧纳米粒（Ca巧加入50 μ L脂质体溶液，混合均匀即得。
[0065] 实施例3aFGF脂质磯酸巧纳米粒凝胶剂的制备
[0066] 按照实施例1制备包含aFGF的脂质磯酸巧纳米粒冻干粉备用，并按照下述方法制 备凝胶剂：
[0067] 各组分的质量百分比如下（质量％ ):
[0068]
[0069]
[0070] 将aFGF脂质磯酸巧纳米粒冻干粉lOg用蒸傭水溶解备用，加入卡波姆Ig、甘油 8邑、山梨酸钟0. 1 Ig，揽拌溶解，加入Η己醇胺2g调节抑值到6-7,加入蒸傭水至全量，揽拌 均匀，制成凝胶lOOg，即得到包含aFGF的脂质磯酸巧纳米粒凝胶剂。
[0071] 该凝胶剂同样具有良好的创面修复作用，由于凝胶的胶黏特性，作用时间更持久， 保湿效果更好，并能有效的隔绝作用部位与空气的接触，避免伤口的感染发炎，并降低过敏 的发生率。使用方便，清洗简单。
[0072] 实施例4皮肤修复乳液
[0073] 组成乳液的产品的组分及百分数含量为：
[0074]
[00巧]制备方法：
[0076] (1)将A组加热到8(TC后揽拌5min溶解均匀，静置冷却至4(TC。
[0077] (2)按照实施例1所述方法制备aFGF脂质磯酸巧纳米粒。将事先混合溶解的B组 分加入上述A组分的混合溶液揽拌均匀。
[0078] (3)将C组分的加入上述两组分的混合溶液，揽拌均匀即得。
[0079] 实施例5皮肤修复霜
[0080] 组成霜的产品的组分及百分数含量为：
[0081]
[0082] 制备方法：
[008引 （1)将A组加热到8(TC后揽拌5min溶解均匀，静置冷却至4(TC。
[0084] (2)将C组分用适量去离子水溶解备用，将C组分加入A组分中，揽拌3min使其均 匀。
[0085] (3)按照实施例1所述方法制备aFGF脂质磯酸巧纳米粒。将事先混合溶解的B组 分加入上述两组分的混合溶液揽拌均匀即得。
[0086] 实施例6aFGF脂质磯酸巧纳米粒促进3T3细胞增殖作用
[0087] 将处于对数生长期的3T3细胞（3T3细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中必） 用含10% FBS(FBS购自杭州四季青生物工程材料有限公司）的DMEM培养基（DMEM培养基 购自美国Gibco公司）常规培养至80%~90%汇合，用0. 25%膜酶消化，W 0. 5X 105个/ ml的细胞数目接种于96孔板，培养2地后，换无血清DMEM培养基培养，24h后将培养基吸出 后分别加入浓度为50、25、12. 5、6. 25、3. 125 μ g/mL的实施例1制备的包裹aFGF脂质磯酸 巧纳米粒、aFGF原液W及空白的脂质磯酸巧纳米粒（不含aFGF)，每个浓度设3个复孔，空 白组为六个复孔。给药后放入培养箱继续培养2地，加入10 μ 1喔哇藍（MTT) (0. 5mg/ml)， 培养箱中赔育地后，吸出孔中溶液并加入150 μ 1 DMS0,振荡后于570皿波长下检测吸光度 0D值。结果见图3和图4。
[0088] 图3结果显示与空白脂质磯酸巧纳米粒对照组比较，aFGF脂质磯酸巧纳米粒具有 显著的促细胞增殖作用。图4结果显示aFGF脂质磯酸巧纳米粒与aFGF细胞原液同样具有 显著的细胞增殖效果，且具有良好的浓度依赖性，表明w脂质磯酸巧纳米粒为载体包裹的 FGF仍然保持着良好的细胞增殖活性。
[0089] 实施例7包裹重组人细胞生长因子的脂质磯酸巧纳米粒稳定性考察
[0090] 分别将上述3批aFGF脂质磯酸巧纳米粒化CP-aFG巧和aFGF水溶液于温度4°C、 25°C和4(TC的条件下密闭放置。于放置后0、1、3、5、10、30、60、90天分别检测两者活性。结 果见图5。
[0091] 图5中（1)为4°C条件下存放时两种样品的活性变化；（2)为25°C条件下存放时 两种样品的活性变化；（3)为4(TC条件下存放时两种样品的活性变化。实验结果显示4Γ、 25°C和4(TC的条件下的aFGF脂质磯酸巧纳米粒组比aFGF原液组降解速度显著降低。表明 脂质磯酸巧纳米粒作为载体具有显著提高内含物细胞生长因子的稳定性，使活性成分在常 温使用条件下仍能保持较高活性，便于长期储存，延长产品有效期。
[0092] 应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神 和范围的条件下，可W在其中进行各种形式和细节的变化，可W进行各种实施方案的任意 组合。
【主权项】
1. 一种以脂质磷酸钙纳米粒为核心的组合物，其包含1~50重量％的脂质体，1~50 重量％磷酸钙，0. 0001~1重量％的细胞生长因子FGF。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质磷酸钙纳米粒的粒径为50nm~ 200nm〇3. 根据权利要求1所述的组合物，其中FGF为通过基因工程技术获得的重组人FGF，主 要为重组人酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF)和重组人碱性细胞生长因子（rhbFGF)。4. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质体磷酸钙以纳米粒形式存在，所述纳 米粒负载有FGF，形成包裹有FGF的脂质体磷酸钙米粒，其制备方法为：（1)将表面活性剂、 助表面活性剂和有机溶剂A按照混合，构成油相三元体系。表面活性剂：助表面活性剂： 有机溶剂A=I~5 : 1~5 : 1~5。将氯化钙水溶液（10~250mM)、磷酸盐水溶液 (10~250mM)以及FGF水溶液（0. 1~0. 5mg/mL)混合，制成水相，氯化钙水溶液：磷酸盐 水溶液：FGF水溶液=10~200 : 10~200 : 10~50。将水相缓慢加入油相充分搅拌， 制成油包水的微乳，室温静置5~15min产生磷酸钙沉淀，将柠檬酸钠溶液（5~50mM)逐滴 加入微乳中，搅拌混合均匀，体系又恢复澄清透明。微乳过Ig 60~200目的硅胶填充的硅 胶柱，用体积比1~5 : 1的乙醇/水为洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪挥干乙醇后即得磷酸钙 纳米粒水溶液。（2)取磷脂和胆固醇按1~10 : 1混合，溶于有机溶剂B中，于50°C旋转蒸 发，除去有机溶剂，形成均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育0. 5~3h，过0. 22 μ m 微孔滤膜，得到脂质体溶液。（3)将（1)、（2)制备所得的溶液按照0.1~10 : 1混合即得。5. 根据权利要求4,步骤（1)中所述的有机表面活性剂为泊洛沙姆、聚乙二醇辛基苯基 醚、十二烷基硫酸钠或聚山梨醇中的一种或几种；所述的助表面活性剂为正己醇、丙二醇、 丙三醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种；所述的有机溶剂A为环己烷、正己烷、正辛烷中的一 种；所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。所述的 rhFGF为重组人成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF (rhFGF)。主 要包括酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF)中的一 种。步骤（2)中所述的有机溶剂B为氯仿、二氯甲烷、乙醇中的一种或几种混合；所述的磷 脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、1，2-二油烯氧基3-三甲 氨基丙烷（D0TAP)、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000)中的一种或几 种，优选1，2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（DOTAP)。6. 根据权利要求1所述的组合物，其还可以通过下述制备所得：（1)将氯化钙水溶 液（10~500mM)、FGF水溶液（0. 1~5mg/mL)以及油相混合，作为混合液A。氯化钙水溶 液：FGF水溶液：油相=0· 05~I : 0· 05~I : 10~30。将磷酸溶液（10~50mM，pH = 9.0)，油相以及磷脂混合，作为混合液B。磷酸盐水溶液：油相：磷脂=0.05~I : 10~ 30 : 0.05~1。将A、B混合20min，加入10~50mL乙醇，12000g离心5~30min，乙醇洗 2-3遍后挥干乙醇，加1~IOmL去离子水制成包含FGF的磷酸钙纳米粒混悬液。（2)取磷 脂和胆固醇按1~10 : 1混合，溶于有机溶剂B中，于50°C旋转蒸发，除去有机溶剂，形成 均匀脂质薄膜。加入同温的蒸馏水室温孵育〇. 5~3h，过0. 22 μ m微孔滤膜，得到脂质体溶 液。⑶将（1)、（2)制备所得的溶液按照0. 1~10 : 1混合即得。7. 根据权利要求6,步骤（1)中所述的油相为环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚 (50-80% : 50-20% )。氯化钙水溶液：FGF水溶液：油相=0· 05~I : 0· 05~I : 10~ 30。所述的磷酸盐水溶液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三聚磷酸钠中的一种或几种。所述 的FGF为成纤维细胞生长因子，优选自基因工程技术获得的重组人FGF (rhFGF)。主要包括 酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF)和碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF)中的一种。步骤 (1)中所述的磷脂为1，2-油酰磷脂酸（DOPA)，1，2-二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC)、二油酰基 磷脂酰乙醇胺（DOPE)中的一种，优选1，2_油酰磷脂酸（DOPA)。步骤（2)中所述的有机溶 剂为氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙醚中的一种或几种混合；所述的磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢 化磷脂、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、1，2_二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（DOTAP)、聚乙二 醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000)中的一种或几种，优选1，2_二油烯氧基 3_三甲氨基丙烷（DOTAP)。8. 权利要求1-7中任一项所述的脂质磷酸钙组合物可作为化妆品原料或活性添加成 分，并可进一步制备成泡沫剂、水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜剂。9. 根据权利要求8,所述的FGF脂质磷酸钙纳米粒在其它制剂中的添加量为1~5重 量％。10. -种皮肤修护系列化妆品，其包含有效量的权利要求1-9中任一项的包裹细胞生 长因子的脂质磷酸钙纳米粒组合物。
【文档编号】A61Q19/00GK105878047SQ201410815272
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月23日
【发明人】黄亚东, 项琪, 贝煜, 郑青, 肖巧学
【申请人】广州暨南大学医药生物技术研究开发中心, 广州市暨鹏生物科技有限公司