超小金属硫族化合物纳米晶、其亲生物合成方法及应用与流程

本发明涉及一种纳米粒子及其制备方法，特别是一种超小尺寸的、单分散的、亲水的，具有生物相容性的金属硫族化合物纳米颗粒(纳米晶)及其制备方法和应用。

背景技术：

硫化物因其独特的光学性质在生物医药尤其是抗肿瘤医药的研究中占有非常重要的地位。例如：CuS，Ag₂S因其在近红外区有着很好的光热效应常被用作光热治疗剂进行研究而CdS与ZnS及其异质结自1998年Chan和Nie及Bruchez等人首次利用CdSe/ZnS和CdSe/CdS量子点成功地标记了HeLa细胞和3T3成纤维细胞之后便被作为生物成像探针进行了深入的研究并取得了长足的发展。但以上硫化物纳米晶的合成还有诸多缺点，下面以CuS纳米晶的制备为例进行进一步说明。

2008年南京大学的Zhao Yixin等系统的阐述了三种制备Cu_2-xS(x＝1，0.2和0.03)的方法并第一次提出Cu_2-xS在近红外的吸收是与载流子浓度有关的等离子体共振吸收而非之前提出的间接带隙跃迁吸收。这三种方法分别是声波电化学合成法(Sonoelectrochemical method)，溶剂热合成法(Hydrothermal method)和无溶剂热解(Solventless thermolysis method)，这三种方法合成的纳米材料分别具有尺寸不均，分散性差，形貌不规则，疏水和无生物相容性等缺点。

2012年英国Mark T.Swihart等采取在油胺，油酸和油胺和油酸混合物溶剂体系中分别用氯化亚铜(CuCl)和硫粉(S)制备铜和硫的前体，然后将硫的前提注入铜的前提溶液中制备Cu_2-xS的方法，通过改变反应温度和溶剂的组成分别制备了2.8nm，6.8nm和13.5nm的Cu_2-xS的尺寸均一的单分散的纳米颗粒。这种溶剂热注入的方法有效提高了颗粒的分散性。但此种方法制备的Cu_2-xS在周围大气环境中非常不稳定，易被氧气所氧化，导致在近红外处的吸收大幅度减弱。

公布号为CN102249291A的发明专利记载了一种基于羊抗人抗体为软模板控制合成纳米粒子硫化汞的制备方法，其主要是以抗体为模板，先加入汞离子，形成蛋白质与汞离子结合 的复合物，再加入硫离子，硫离子与蛋白质分子上的汞离子结合形成表面修饰羊抗人抗体的硫化汞纳米粒子，但这种技术还存在一些缺陷，例如硫化汞纳米粒子较大(平均粒径大于10nm)，且不适于在体内应用。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种超小尺寸金属硫族化合物纳米晶及其亲生物合成方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

在本发明的一实施方案之中提供了一种超小尺寸金属硫族化合物纳米晶(简称超小金属硫族化合物纳米晶)的亲生物合成方法，其包括：将等电点PI低于9.0的蛋白质、金属盐于水中均匀混合形成混合溶液，再加入硫源或硒源，经反应后形成粒径在10nm以下的超小尺寸金属硫族化合物纳米晶。该实施方案尤其适于合成ZnS和Ag₂S纳米晶等。

在本发明的一实施方案之中，所述亲生物合成方法还可包括：将蛋白质、金属盐于水中均匀混合形成混合溶液，并调节所述混合溶液至呈碱性，再加入还原剂和硫源，经反应后形成超小尺寸金属硫族化合物纳米晶。

在一较为具体的实施方案之中，所述亲生物合成方法进一步包括：在室温下将可溶性金属盐及蛋白质加入水中并拌混合均匀，形成混合溶液，再以碱性物质将所述混合溶液调节至呈碱性，并持续搅拌，之后加入还原剂，搅拌至混合溶液变色，然后快速加入硫化物，并调节温度至60～80℃，充分反应后冷却至室温，获得所述超小金属硫族化合物纳米晶。

作为较为优选的实施方案之一，所述蛋白质可选自牛血清白蛋白(PI＝4.7)，血清白蛋白(PI＝4.7-4.9)，卵白蛋白(PI＝4.95-4.71)，肌清蛋白(PI＝3.5)，γ1-球蛋白(PI＝5.8，6.6，7.3，8.2)γ2-球蛋白(PI＝5.2-5.5)，珠蛋白(PI＝7.5)，伴清蛋白(PI＝6.8，7.1)，肌浆蛋白(PI＝6.3)，β-乳球蛋白(PI＝5.1-5.3),卵黄蛋白(PI＝4.8-5.0)，肌球蛋白(PI＝5.1),原肌球蛋白(PI＝5.9)，铁传递蛋白(PI＝3.4-3.5)，胎球蛋白(PI＝5.5-5.8)，肌红蛋白(PI＝7.07)，血红蛋白(人)(PI＝7.23)，血红蛋白(鸡)(PI＝6.92)，血红蛋白(马)(PI＝4.6-6.4)，血蓝蛋白(PI＝5.6)，蚯蚓血红蛋白(PI＝4.3-4.5)，血绿蛋白(PI＝4.6-6.2)，α1-脂蛋白(PI＝5.4)，β1-脂蛋白(PI＝5.9)，β-卵黄脂磷蛋白(PI＝3.75)，血纤蛋白原(PI＝4.8)，α-眼晶体蛋白(PI＝6.0)，β-眼晶体蛋白(PI＝5.1)，花生球蛋白(PI＝3.9)，伴花生球蛋白(PI＝3.7-5.0)，角蛋白类(PI＝4.6-4.7)，还原角蛋白 (PI＝6.5-6.8)，胶原蛋白(PI＝4.8-5.2)，鱼胶(PI＝4.7-5.0)，白明胶(PI＝4.0-4.1)，α-酷蛋白(PI＝4.5)，β-酷蛋白(5.8-6.0)，γ-酷蛋白(3.83-4.41)，α-卵清粘蛋白(PI＝1.8-2.7)α1-粘蛋白(PI＝5.5)，卵黄类粘蛋白(PI＝3.2-3.3)，甲状腺球蛋白(PI＝4)等中性及酸性蛋白，但不限于此。

进一步的，所述金属盐可以选自铜盐、镉盐、锌盐、银盐，铁盐、铅盐或其水合物，例如，铜盐包括氯化铜及其水合物，硝酸铜及其水合物，硫酸铜及其水合物，醋酸铜及其水合物中的一种或几种；镉盐包括氯化镉及其水合物、硝酸镉及其水合物、醋酸镉及其水合物中的一种或几种；锌盐包括氯化锌、硝酸锌及其水合物、醋酸锌及其水合物中的一种或几种；银盐包括硝酸银和醋酸银中的一种或两种，但不限于此。

进一步的，所述还原剂包括水合肼，但不限于此。

进一步的，所述硫化物可优选自硫化钠及其水合物，硫化钾及其水合物，硫化铵及其水合物等，但不限于此。

进一步的，本发明中可采用碱性物质将混合溶液调节至呈碱性，所述碱性物质可以为强碱或者弱碱，例如，强碱包括氢氧化钠，氢氧化钾；弱碱包括氨水，但不限于此。

在本发明的一具体实施方案之中，一种以蛋白质为模板制备超小尺寸金属硫族化合物纳米晶的亲生物合成方法可以包括以下步骤：

1)将相应的阳离子盐溶液(CuCl₂、CdCl₂、ZnCl₂、AgNO₃等)与一定量的蛋白质分散在水溶液中，室温搅拌混合均匀；

2)向反应体系中注入与步骤1)等体积的碱性溶液，将反应体系调至碱性，继续室温搅拌。

3)搅拌5min后，加入85％的水合肼，搅拌2min后溶液变色；

4)快速注入微量的硫化物溶液，升高温度，反应2h后冷却至室温得到纳米晶胶体溶液；

5)用超滤管，进行超滤浓缩和洗涤，将游离的蛋白质除去。

其中，ZnS和Ag₂S纳米晶的制备不需要第2)和第3)步骤。

在本发明的一更为具体实施方案之中提供的超小CuS纳米晶合成方法可以包括以下步骤：

1)通过搅拌在室温下将一定质量的蛋白质与铜盐水溶液混合均匀。

2)向以上均匀溶液中注入一定pH值的碱性溶液，将反应溶液调至碱性。

3)注入微量的85％的水合肼使Cu²⁺被还原为Cu₂O。

4)加入硫化物的水溶液，将Cu₂O硫化，即可以得到超细的CuS纳米晶体颗粒。

优选的，步骤4)中注入硫化物溶液后，反应温度在56～70℃之间。

在本发明的一典型实施例之中，一种CuS纳米晶的合成方法可以包括以下步骤：

Ⅰ、铜盐溶液的配制

称取一定质量的铜盐将其溶解于去离子水中，制成0.05mol/L铜盐溶液，具体实施例中所用的铜盐为二水合氯化铜(CuCl₂·2H₂O),称取的CuCl₂·2H₂O的质量为231.1mg,加水稀释，然后置入25ml的容量瓶中，加水至刻度，即制成25ml的0.05mmol/L的CuCl₂溶液。

Ⅱ、硫化物溶液的制备

称取一定质量的硫化物将其溶解于去离子水中，制成320mg/ml的硫化物溶液，具体实施例中所用的硫化物为九水合硫化钠(Na₂S·9H₂O)，称取3490mg的Na₂S·9H₂O溶于5ml水中，搅拌至完全溶解，即得到320mg/ml的Na₂S溶液。

Ⅲ、超小尺寸CuS纳米晶的制备

1)取0.05M的CuCl₂溶液1.0mL，牛血清白蛋白(BSA，Mw＝66,430KDa)80mg和24mL去离子水置入100mL的两颈圆底烧瓶中，在室温下，磁力搅拌0.5h使其充分混匀。

2)向反应体系中注入25ml的NaOH溶液(PH＝9.0)，继续室温搅拌。

3)搅拌5min后，加入7.5uL的85％的水合肼，搅拌2min后溶液变为浅黄色。

4)快速注入100uL浓度320mg/ml的Na₂S溶液，60℃下，反应2h后冷至室温得到浅绿色溶液。

5)用100KDa的超滤管，离心机转速设定为3000RPM，进行超滤浓缩洗涤，以除去游离的BSA蛋白分子等。

在本发明的一实施方案之中还提供了采用前述任一种方法制备的超小尺寸金属硫族化合物纳米晶。

所述纳米晶可以是Cu_xS、ZnS、Fe_yS_z、CdS、AgS、Ag₂S、PbS、Cu_xSe或CdSe纳米晶等，1≤x<2，0.5≤y/z≤1，尤其优选自CuS、CdS、Ag₂S和ZnS纳米晶，其粒径在10nm以下，特别是小于10nm。

在本发明的一实施方案之中还提供了所述超小金属硫族化合物纳米晶的用途，例如在制备生物检测试剂或疾病治疗药剂中的应用。

在一实施例之中提供了一种生物荧光成像制剂，其包含所述超小金属硫族化合物纳米晶。

在一实施例之中提供了一种光热治疗制剂，其包含所述超小金属硫族化合物纳米晶。

本发明选择蛋白质为模板制备超小尺寸金属硫族化合物纳米晶，主要是利用蛋白质上解离的羧基功能团与纳米颗粒表面的二价铜离子离子具有良好配位能力的特性，直接制备与生物相容的的纳米颗粒，且还充分利用了蛋白质羧基和氨基官能团及其在不同pH值下的带电特性以及其空间结构实现了超小尺寸金属硫族化合物(例如CuS)纳米颗粒在水溶液中以及在生物体液及血液中的稳定性。

进一步的，本发明采用蛋白质，尤其是来自人体的一些蛋白例如血清蛋白，血浆蛋白，血红蛋白等作为模板，一方面是因其对人体完全相容无毒害作用，另一方面，还因此类蛋白在反应过程中至少具有如下作用：一是作为表面活性剂可以控制纳米晶的生长、尺寸大小以及形貌；二是蛋白质在PH值高于其等电点的溶液环境中，羧基和氨基发生解离使蛋白质带负电，失去氢质子的羧基变为羧酸根负离子，羧酸根离子会与金属离子，例如Cu²⁺离子发生配位，另一部分未参与配位的羧基基团实现了对纳米颗粒表面的羧基化，使纳米晶稳定均匀分散于水环境中并且蛋白质的空间结构进一步提高了CuS胶体的稳定性；三是未配位自由的羧基基团和氨基基团可以进一步用于交联DNA、RNA、荧光分子等功能材料，用于生物医学检测和治疗。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明提供的基于蛋白的亲生物合成方法，具有反应条件温和，操作简单，颗粒表面不需额外修饰就可直接用于生物光热治疗等特点；

(2)本发明提供的超小尺寸金属硫族化合物纳米晶尺寸均匀，分散性好，稳定性高并且不需其他表面修饰就有非常好的生物相容性，且还具有光热效应，例如本发明提供的CuS纳米颗粒小于10nm，通过血液循环就可以达到生物体各个组织和器官，而且容易排出体外，对生物体不会造成危害，是一种低成本的具有很大应用前景的用于光热治疗和生物荧光成像的纳米材料。

附图说明

图1是本发明一些实施方案之中合成的典型CuS、CdS、Ag₂S和ZnS纳米晶的TEM图片；

图2是本发明一些实施方案之中合成的生物相容的超细CuS、CdS、Ag₂S和ZnS纳米晶 分散在水溶液中的照片和在390nm激光照射下的丁达尔效应图片；

图3是本发明一实施方案之中合成的生物相容的超细CuS纳米晶在可见-近红外光区范围内的吸收光谱图；

图4是本发明一实施方案之中以BSA为模板制备的Ag₂S纳米晶在可见-近红外处的吸收光谱图；

图5是本发明一实施方案之中以BSA为模板制备的CdS和ZnS纳米晶在可见-近红外处的吸收光谱图；

图6a-图6b是本发明一实施例之中CuS纳米晶水溶液在808nm激光照射下温度随时间的变化曲线图；

图7a-图7b是本发明一实施例之中Ag₂S纳米晶水溶液在808nm激光照射下温度随时间的变化曲线图；

图8是本发明一实施方案之中CuS纳米晶和CuS纳米晶光热效应对细胞存活率的影响图；

图9是本发明一实施方案之中Ag₂S纳米晶和Ag₂S纳米晶光热效应对细胞存活率的影响图；

图10是本发明一实施方案之中MCF-7细胞经不同处理后荧光成像的照片；

图11是本发明一实施方案之中经含有Ag₂S纳米晶的培养液培养之后施加808nm光照后Hela细胞形态图片(圆圈内为光照部位)；

图12是本发明一实施方案之中分别向荷4T1瘤老鼠的皮下注入CuS纳米晶和Ag₂S纳米晶在808nm光照下的小鼠照片。

具体实施方式

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，这些实施例以本发明为前提，但本发明的保护范围包括但不限于下列实施例。

实施例1以牛血清白蛋白(BSA)为模板制备超小CuS纳米晶，包括如下步骤：

1.取0.05mol/L的CuCl₂溶液1.0mL，牛血清白蛋白(BSA，Mw＝66,430KDa)80mg和24mLl去离子水置入100mL的两颈圆底烧瓶中，在室温下，磁力搅拌0.5h使其充分混匀,搅拌速度不宜太大，防止蛋白质形成大量泡沫。

2.向反应体系中注入25ml的NaOH溶液(PH＝9.0)，继续室温搅拌。

3.搅拌5min后，加入7.5uL的85％的水合肼，搅拌2min后溶液变为浅黄色。

4.快速注入320mg/mL的Na₂S溶液100uL，升温至60℃，在此温度下反应2h后冷至室温得到浅绿色溶液。

5.用100KDa的超滤管，离心机转速设定为3000RPM，进行超滤浓缩洗涤，以除去游离的BSA蛋白分子，最后将产品分散到4.0mL的去离子水中备用，得到产品的浓度为1.2mg/mL。

实施例2以牛血清白蛋白(BSA)为模板制备超小CdS纳米晶，包括如下步骤：

1.取0.05mol/L的CdCl₂溶液1.0mL，牛血清白蛋白(BSA，Mw＝66,430KDa)80mg和24mL去离子水置入100mL的两颈圆底烧瓶中，在室温下，磁力搅拌0.5h使其充分混匀,搅拌速度不宜太大，防止蛋白质形成大量泡沫。

2.向反应体系中注入25mL的NaOH溶液(PH＝9.0)，继续室温搅拌。

3.快速注入100uL浓度320mg/ml的Na₂S溶液，升温至60℃，在此温度下反应2h后冷至室温得到黄色溶液。

4.用100KDa的超滤管，离心机转速设定为3000RPM，进行超滤浓缩洗涤，以除去游离的BSA蛋白分子，最后将产品分散到4ml的去离子水中备用。

实施例3以牛血清白蛋白(BSA)为模板制备超小尺寸ZnS纳米晶，包括如下步骤：

1.取0.05mol/L的ZnCl₂溶液1.0mL，牛血清白蛋白(BSA，Mw＝66,430KDa)80mg和24mL去离子水置入100mL的两颈圆底烧瓶中，在室温下，磁力搅拌0.5h使其充分混匀,搅拌速度不宜太大，防止蛋白质形成大量泡沫。

2.快速注入100uL浓度320mg/ml的Na₂S溶液，升温至80℃，在此温度下反应2h后冷至室温得到无色溶液。

3.用100KDa的超滤管，离心机转速设定为3000RPM，进行超滤浓缩洗涤，以除去游离的BSA蛋白分子，最后将产品分散到4.0mL的去离子水中备用。

实施例4以牛血清白蛋白(BSA)为模板制备超细Ag₂S纳米晶，包括如下步骤：

1.取0.05mol/L的AgNO₃溶液1ml，牛血清白蛋白(BSA，Mw＝66,430KDa)80mg和24ml去离子水置入100ml的两颈圆底烧瓶中，在室温下，磁力搅拌0.5h使其充分混匀,搅拌速度不宜太大，防止蛋白质形成大量泡沫。

2.快速注入50uL浓度320mg/mL的Na₂S溶液，升温至80℃，在此温度下反应2h后冷至室温得到棕色溶液。

3.用100KDa的超滤管，离心机转速设定为3000RPM，进行超滤浓缩洗涤，以除去游离的BSA蛋白分子，最后将产品分散到4.0mL的去离子水中备用。

进一步的，本案发明人还对前述实施例1-4合成的超小纳米晶进行了表征和测试，其结果具体如下：

请参阅图1所示是本发明实施例1-4中合成的典型CuS、CdS、Ag₂S和ZnS纳米晶的TEM图片。

而图2所示是本发明实施例1-4中合成的生物相容的超细CuS、CdS、Ag₂S和ZnS纳米晶分散在水溶液中的照片和在390nm激光照射下的丁达尔效应图片。

图3所示是前述生物相容的超细CuS纳米晶在可见-近红外光区范围内的吸收光谱图。

图4所示是前述以BSA为模板制备的Ag₂S纳米晶在可见-近红外处的吸收光谱图。

图5所示是前述以BSA为模板制备的CdS和ZnS纳米晶在可见-近红外处的吸收光谱图。

图6a-图6b是前述CuS纳米晶水溶液在808nm激光照射下温度随时间的变化曲线图，其中图6a为96μg/ml的CuS纳米晶水溶液在不同光照功率密度下的温度变化曲线图，图6b为不同浓度的CuS纳米晶水溶液在2.8W/cm²功率密度的照射下温度随时间的变化曲线图。

图7a-图7b是前述Ag₂S纳米晶水溶液在808nm激光照射下温度随时间的变化曲线图，其中图7a为258μg/ml的Ag₂S纳米晶水溶液在不同光照功率密度下的温度变化曲线图，图7b为不同浓度的Ag₂S纳米晶水溶液在3.90W/cm²功率密度的照射下温度随时间的变化曲线图。

图8是前述CuS纳米晶和CuS纳米晶光热效应对细胞存活率的影响图。

图9是前述Ag₂S纳米晶和Ag₂S纳米晶光热效应对细胞存活率的影响图。

图10是本发明一实施方案之中MCF-7细胞经不同处理后荧光成像的照片，其中a：Control组；b：施加808nm的激光照射10min，其余条件与Control组相同；c：用含有100ug/ml CuS纳米晶的培养液培养12h；d：用含有100ug/ml CuS纳米晶的培养液培养4h后施加功率密度为4.75W/cm²的808nm的光照；e：用含有80ug/ml CuS纳米晶的培养液培养4h后施加功率密度为4.75W/cm²的808nm的光照：f：用含有50ug/ml CuS纳米晶的培养液培养4h后施加功率密度为4.75W/cm²的808nm的光照。

图11是本发明一实施方案之中经含有Ag₂S纳米晶的培养液培养之后施加808nm光照后Hela细胞形态图片(圆圈内为光照部位)。

图12是本发明一实施方案之中分别向荷4T1瘤老鼠的皮下注入CuS纳米晶和Ag₂S纳米晶在808nm光照下的小鼠照片，可以看到，注入纳米晶之前，小鼠肿瘤非常明显，然后分别注入30uL的3.2mg/ml和4.16mg/ml的CuS和A_g2S纳米晶的PBS溶液后，在激光密度为1.5W/cm²的808nm光照6分钟，老鼠的肿瘤在光热治疗下，发现7天后小鼠的肿瘤块结痂消退，10天后无肿瘤再生。

此外，本案发明人还参照前述实施例的方法，并利用前述的其它蛋白等进行了Cu_xS(1<x<2)，FeS，Fe_yS_z，PbS，CuSe，Cu_xSe(1<x<2)以及CdSe纳米晶等的合成，经表征发现，其粒径均小于10nm，而其可见-近红外吸收光谱及生物学性能等方面的表现与前述实施例产品亦基本相似。

需要说明的是，本发明所揭示的乃较佳实施例的多种，凡是局部的变更或修饰而源于本发明的技术思想而为熟习该项技术的人所易于推知的，俱不脱离本发明的专利权范围。