水分散性碳纳米洋葱的制备方法及其应用与流程

本发明属于纳米材料领域，尤其涉及一种水分散性良好且具有高光热转换率的碳纳米洋葱的制备方法及其在肿瘤光热治疗中的应用。

背景技术：

2012年世界范围内与癌症相关的死亡人数有约800万，新增癌症患者1400万。目前癌症的主要治疗方法有手术、放疗和化疗三种，但是手术治疗不能彻底清除癌细胞，放疗、化疗在治疗过程中会引起严重的副作用。光热疗法是一种新兴的癌症治疗方法，它具有副作用小、清除肿瘤能力强等优势。光热治疗肿瘤的基本原理为：多数生物组织对波长位于700–1100nm的近红外光吸收很弱，而光热试剂对有此波段强烈的吸收并将之转化为热，首先使光热试剂在肿瘤区域富集，然后利用近红外光照射肿瘤区域，光热试剂产生的热量会将该区域的细胞杀死。

目前生物医学领域已开发的光热试剂主要有金属基材料、碳基材料、聚合物纳米材料、有机小分子等。金属基材料包括：金纳米棒、钯片、金属硫化物(硫化铜、硫化铋、硫化钼)等；碳基材料包括：碳纳米管(单壁碳纳米管、复壁碳纳米管)、石墨烯类材料(氧化石墨烯、还原的氧化石墨烯)等；聚合物纳米材料包括：聚多巴胺、聚吡咯等；有机小分子包括吲哚菁绿、IR825等。然而上述材料多存在毒性较大、价格高昂、制备复杂、生理条件下分散不稳定或热不稳定等缺点。

碳纳米洋葱是碳材料家族的新成员，它于1980年被Iijima发现(J.Cryst.Growth 1980,50,675.)，在1992年首次被Ugarte描述形貌(Nature 1992,359,707.)。目前碳纳米洋葱主要被用于电化学储能领域(J.Mater.Chem.A 2015,4,3172.)，而其在生物医学领域的应用鲜有报道。2007年Liu等人首次将蜡烛灰制备为碳量子点，用于细胞成像(Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,6473.)。2009年Ray等用与本文不同方法将蜡烛灰制成碳量子点和可溶性碳纳米颗粒(J.Phys.Chem.C 2009,113,18546.)，并做了较为详细的表征。但上述碳量子点在近红外区吸收很弱，不具备成为光热试剂的条件。考虑到碳材料通常具有较好的生物相容性，因此制备具有优异近红外光热转换性能的碳纳米材料在生物医学领域具有重要的应用前景。但是目前利用活性炭(J.Mater.Chem.B 2014,2,2184.)和竹炭(Adv.Healthc.Mater.2016,1627.)等其他无定型碳制备的碳纳米材料的光热转化率均不高，不能得到有效利用。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的碳纳米洋葱制备复杂，无定形碳制备所得碳纳米材料光热转化率较低等问题，本发明提供了一种以蜡烛灰为原料，用简单的方法制备水分散性碳纳米洋葱的方法，还提供了制备所得性能优异、光热转化率较高的水分散性碳纳米洋葱的应用。

技术方案：本发明所述的一种水分散性碳纳米洋葱的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备蜡烛灰：将载玻片在燃烧的蜡烛外焰中往复移动，待载玻片表面覆盖一层均匀的蜡烛灰之后移除火焰，将载玻片冷却至室温，收集蜡烛灰；

(2)氧化反应：将步骤(1)收集的蜡烛灰加入到强酸溶液中，超声处理获得碳纳米洋葱溶液；

(3)纯化并保存：向步骤(2)制备所得碳纳米洋葱溶液加水进行离心洗涤，洗涤后超声分散于水中得水分散性碳纳米洋葱，保存即可。

步骤(2)中，所述强酸溶液为体积比为1：1–3：1的浓硫酸与浓硝酸混合溶液。

优选的，步骤(2)中，所述强酸溶液为体积比为2：1的浓硫酸与浓硝酸混合溶液。

步骤(2)中，所述蜡烛灰在强酸溶液中的浓度为0.1–10mg/mL。

优选的，步骤(2)中，所述蜡烛灰在强酸溶液中的最优浓度为0.5–2mg/mL。

步骤(2)中，所述超声处理是指在50℃以上处理2–6小时。

优选的，步骤(2)中，所述超声处理是指在50℃处理4小时。

步骤(3)中，加水在10000–30000转/分钟的转速下离心清洗3次以上，离心时间为5–20分钟。其中，随着洗涤时分散液酸性的减弱，离心转速应逐渐提高，离心时间应逐渐加长。优选的，离心转速为15000转/分钟，离心洗涤4次，第一次离心时间为5分钟，后三次离心时间为20分钟。

步骤(3)中，洗涤后超声分散于水中得水分散性碳纳米洋葱是指，加水并超声重悬碳纳米洋葱，以转速6000转/分钟离心5分钟后弃沉淀取上层分散液，于室温或4℃保存。离心优选转速6000转/分钟、时间5分钟以除去较大颗粒。

根据上述制备方法制备所得水分散性碳纳米洋葱在肿瘤光热治疗中的应用也在本发明的保护范围内。

另外，本发明制备所得水分散性碳纳米洋葱表面富含亲水性的基团，包括羧基、羟基等，可利用其中的羧基等活性基团与带氨基的分子进行接枝，使之进一步功能化。使得该碳纳米洋葱具有广泛用途，包括但不局限于：(1)肿瘤的光热治疗；(2)光声成像；(3)共价接枝药物分子、作为药物载体，实现协同治疗。

有益效果：本发明将蜡烛灰应用于碳纳米洋葱的制备中，制得的碳纳米洋葱具有纯净度高、水溶液中分散稳定、高光热转化率、光热稳定性佳、细胞毒性低、可表面修饰、合成快速简单、以及成本低廉等优点。具体而言，本发明方法相比于现有的光热试剂具有以下突出的优势：(1)高光热转化率：该碳纳米洋葱在波长为808nm的近红外激光照射下，光热转化率达57.5％；(2)细胞毒性低：该碳纳米洋葱在200μg/mL的浓度下，对鼠源宫颈癌细胞(U14)和人源乳腺癌细胞(MCF-7)均无明显毒性；(3)稳定性佳：该碳纳米洋葱可在水中稳定分散6个月以上；无需经聚乙二醇(PEG)表面修饰即可在磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM培养基、RPMI 1640培养基中长时间稳定分散；(4)光热稳定性高：该碳纳米洋葱经过多轮近红外光照射后仍可升温至第一轮最高温度；(5)合成快速简单：从蜡烛灰到最终的碳纳米洋葱，制备过程只需数小时；(6)可表面修饰：该碳纳米洋葱表面富含亲水性的基团，包括羧基、羟基等，可利用其中的羧基等活性基团与带氨基的分子进行接枝，使之进一步功能化，使得该碳纳米洋葱具有广泛用途，包括但不局限于：肿瘤的光热治疗、光声成像、共价接枝药物分子、作为药物载体，实现协同治疗等。

附图说明

图1为本发明制备的碳纳米洋葱分散于磷酸盐缓冲液(PBS)、RPMI 1640培养基、DMEM培养基的照片；

图2为本发明制得的碳纳米洋葱的扫描电子显微镜(SEM)图；

图3为本发明制得的碳纳米洋葱的透射电子显微镜(TEM)图；

图4为本发明制得的碳纳米洋葱的高分辨透射电子显微镜(HRTEM)图；

图5为本发明制得的碳纳米洋葱水溶液的紫外-可见(UV-vis)吸收光谱图；

图6为本发明制得的碳纳米洋葱对小鼠宫颈癌细胞(U14)和人乳腺癌细胞(MCF-7)的毒性；

图7为本发明制得的碳纳米洋葱在不同浓度下的升温效果；

图8为本发明制得的碳纳米洋葱经过多轮光照的升温降温曲线；

图9为本发明制得的碳纳米洋葱对人乳腺癌细胞(MCF-7)的光热杀伤效果；

图10为本发明制得的碳纳米洋葱经过聚乙烯亚胺(PEI)、二氢卟吩e6(Ce6)、聚乙二醇(PEG)共价修饰后产物的紫外-可见(UV-vis)吸收光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出详细说明。

实施例1

一种水分散性碳纳米洋葱的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备蜡烛灰：将载玻片在燃烧的蜡烛外焰中往复移动，待载玻片表面覆盖一层均匀的蜡烛灰之后移除火焰，将载玻片冷却至室温，收集蜡烛灰；

(2)氧化反应：将步骤(1)收集的蜡烛灰加入到体积比为2：1的浓硫酸与浓硝酸混合溶液中，浓度为2mg/mL在温度为50℃下超声4小时，获得碳纳米洋葱溶液；

(3)纯化并保存：向步骤(2)制备所得碳纳米洋葱溶液加水用转速15000转/分钟离心洗涤，重复4次，第一次离心时间为5分钟，后三次离心时间均为20分钟；完成洗涤后，加水并超声重悬碳纳米洋葱，以转速6000转/分钟离心5分钟，弃沉淀取上层分散液，保存于4℃。

制备所得的水分散性碳纳米洋葱在不同溶液(磷酸盐缓冲液(PBS)、RPMI 1640培养基、DMEM培养基)条件下的照片、扫描电子显微镜图(SEM)、透射电子显微镜图(TEM)、高分辨透射电子显微镜图(HRTEM)、紫外-可见(UV-vis)吸收光谱图分别见图1-5。

实施例2

该实施例制备方法同实施例1，只是步骤(1)中浓硫酸与浓硝酸体积比为1：1。

实施例3

该实施例制备方法同实施例1，只是步骤(1)中浓硫酸与浓硝酸体积比为3：1。

实施例4

该实施例制备方法同实施例1，只是步骤(2)中蜡烛灰的浓度为1mg/mL，超声时间为2小时。

实施例5

该实施例制备方法同实施例1，只是步骤(2)中蜡烛灰的浓度为10mg/mL，超声时间为2小时。

实施例6

该实施例制备方法同实施例1，只是步骤(2)中蜡烛灰的浓度为10mg/mL，超声时间为4小时。

实施例7

该实施例制备方法同实施例1，只是步骤(2)中蜡烛灰的浓度为10mg/mL，超声时间为6小时。

实施例8

该实施例制备方法同实施例1，只是步骤(2)中蜡烛灰的浓度为0.1mg/mL，超声时间为2小时。

实施例9

测试实施例1制备所得水分散性碳纳米洋葱的细胞毒性，方法如下：

选择人源乳腺癌细胞(MCF-7)和鼠源宫颈癌细胞(U14)，采用MTT法分别测定浓度为0、10、20、50、100和200μg/mL的碳纳米洋葱对两种细胞的毒性。实验结果见图6，表明在上述浓度范围内，碳纳米洋葱对细胞无明显毒性。

实施例10

测试实施例1的碳纳米洋葱的光热升温效果，方法如下：

分别配置300μL浓度为5、10、20、30、50、100和200μg/mL的碳纳米洋葱分散液，利用波长为808nm、功率密度为2W/cm²的激光器照射碳纳米洋葱分散液10分钟，同时用红外热成像仪记录升温情况。实验结果见图7。

实施例11

测试实施例1的碳纳米洋葱的光热转化率，方法如下：

配置300μL浓度为50μg/mL的碳纳米洋葱，利用波长为808nm、功率密度为2W/cm²的激光器照射碳纳米洋葱分散液10分钟，再自然降温，全过程用红外热成像仪记录温度变化情况。根据Wang等报道的方法(Adv.Funct.Mater.2016,26,5335)计算得到实施例1中的碳纳米洋葱的光热转化率为57.5％，超过了多数现有报道的数据。

实施例12

测试实施例1的碳纳米洋葱的光热稳定性，方法如下：

配置300μL浓度为50μg/mL的碳纳米洋葱，利用波长为808nm、功率密度为2W/cm²的激光器照射碳纳米洋葱分散液10分钟，再自然降温，如此往复5轮，全过程用红外热成像仪记录温度变化情况。实验结果见图8，表明碳纳米洋葱的光热稳定性较好。

实施例13

为证明碳纳米洋葱在光热治疗肿瘤中的应用，开展如下实验：

将人源乳腺癌细胞(MCF-7)以5000个/孔的密度，每孔100μL种于96孔板，在培养箱中培养24小时；每孔用磷酸盐缓冲液洗涤2次后，加入分别含有0、25、50和100μg/mL碳纳米洋葱的培养基，放回培养箱培养4小时；利用波长为808nm、功率密度为0.8W/cm²的激光器照射除对照组外的所有孔10分钟；每孔用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入不含碳纳米洋葱的培养基，放回培养箱培养24小时；采用MTT法测定相对细胞活性。实验结果见图9，表明碳纳米洋葱对肿瘤细胞的光热杀伤效果明显。

实施例14

为证明碳纳米洋葱可通过表面修饰共价接枝药物分子，以便用于肿瘤的协同治疗，开展如下实验：首先活化碳纳米洋葱表面的羧基，即进行1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/琥珀酸亚胺(NHS)处理，碳纳米洋葱与EDC·HCl和NHS的质量比为2：6：9，反应溶液为0.1M、pH＝5.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液。活化在超声中进行，时间为30分钟。然后向其中加入溶解在0.1M MES中的聚乙烯亚胺(分子量600.99，记作PEI 600)，PEI 600与碳纳米洋葱的质量比为10：1，超声30分钟后震荡反应24小时。通过转速15000转/分钟离心10分钟，水洗3次，超声分散于水后得到氨基化碳纳米洋葱。接下来用相同方法活化二氢卟吩e6(Ce6)，具体接枝比例可按需调节，本例中Ce6与碳纳米洋葱的质量比为1：2。最后向活化好的Ce6中加入上述氨基化碳纳米洋葱、琥珀酸亚胺酯-聚乙二醇5000(NHS-PEG5k)，NHS-PEG5k与碳纳米洋葱的质量比为5：1，超声30分钟后震荡反应24小时。通过转速15000转/分钟离心，水洗3次，超声分散于水后得到共价接枝Ce6、PEG的氨基化碳纳米洋葱。接枝后产物和Ce6的紫外-可见吸收光谱如图10所示，实验结果表明Ce6能够成功接枝到碳纳米洋葱表面。由UV-vis计算得到产物中Ce6与碳纳米洋葱的质量比为42：100，接近投料量50：100。此外该法制得的Ce6、PEG共价接枝碳纳米洋葱可稳定分散于PBS中数天。